2結(jié)果與分析
2.1 rJEV-EI176R病毒的生物信息學(xué)分析
2.1.1 E基因的凝膠電泳及測(cè)序分析
以重組病毒rSA14和rJEV-EI176R的基因組cDNA為模板擴(kuò)增E基因，得到的基因片段大小為1 500 bp(圖1)，符合預(yù)期大小。經(jīng)過(guò)測(cè)序和DNA‐MAN 6軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)，rJEV-EI176R病毒的E蛋白2394相對(duì)于rSA14，只在176位點(diǎn)氨基酸處發(fā)生了I-R的變化(圖2)。
2.1.2 rJEV-EI176R的E蛋白氨基酸序列特征分析
對(duì)rSA14和rJEV-EI176R的E蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析(表2)可知，其氨基酸數(shù)量均為500個(gè)。但由于進(jìn)行了I-R的突變，分子的重量、原子的組成占比發(fā)生了細(xì)微的變化，rJEV-EI176R的帶正電荷殘基增加了1個(gè)，理論等電點(diǎn)升高了0.37，由7.31升高到了7.68；不穩(wěn)定指數(shù)升高了0.39，由25.92升高到了26.31。
2.1.3 rJEV-EI176R的E蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
利用SOPMA在線預(yù)測(cè)工具對(duì)rSA14和rJEV?EI176R的E蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，如圖3所示，在176位點(diǎn)經(jīng)過(guò)I-R突變后，E蛋白α螺旋、β折疊、延伸鏈以及無(wú)規(guī)則卷曲的數(shù)量及占比均發(fā)生了改變。在rSA14病毒E蛋白中，α螺旋數(shù)量為110、占比22%，β折疊數(shù)量為30、占比6%，延伸鏈數(shù)量為156、占比31.2%，無(wú)規(guī)則卷曲數(shù)量為204、占比40.8%；與rSA14相比，在rJEV-EI176R病毒E蛋白中，α螺旋數(shù)量減少8個(gè)，占比下降1.6%(102,20.4%)、β折疊數(shù)量增加5個(gè)，占比增加1%(35,7%)、延伸鏈數(shù)量增加2個(gè)，占比增加0.4%(158,31.6%)以及無(wú)規(guī)則卷曲數(shù)量增加1個(gè)，占比增加0.2%(205,41%)。說(shuō)明E蛋白176位點(diǎn)I-R的突變能夠引起E蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化能夠影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的功能發(fā)生改變。
2.1.4 rJEV-EI176R的E蛋白氫鍵連接分析
經(jīng)Pymol作圖分析176位點(diǎn)的I突變?yōu)镽后，由非極性氨基酸變成了極性帶正電荷的氨基酸，突變前與突變后E176位點(diǎn)氨基酸與附近氨基酸有了不同的連接，rSA14病毒E蛋白176位點(diǎn)與E188L有2個(gè)氫鍵的連接，rJEV-EI176R病毒E蛋白176位點(diǎn)與E168T有1個(gè)氫鍵連接，與E188L有2個(gè)氫鍵連接(圖4)。
2.2 rJEV-EI176R的生長(zhǎng)特性分析
2.2.1 rJEV-EI176R的生長(zhǎng)曲線及蝕斑測(cè)定
倍比稀釋E蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，初始質(zhì)粒拷貝數(shù)為26 800，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-3.33X+30.33，R2為0.9。2種病毒以MOI=0.01接種BV-2細(xì)胞，收取細(xì)胞上清液進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，繪制0~72 h的生長(zhǎng)曲線，如圖5A所示，rSA14和rJEV?EI176R病毒在0~48 h之間增殖量有明顯的上升，其后略有下降，但保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。2株病毒的生長(zhǎng)曲線并沒(méi)有顯著的差異，說(shuō)明突變不影響2株病毒在BV-2細(xì)胞上的增殖。將BHK-21細(xì)胞接種至6孔板，長(zhǎng)滿后進(jìn)行蝕斑實(shí)驗(yàn)，并用結(jié)晶紫染色，隨后6孔板中出現(xiàn)2株病毒的蝕斑形態(tài)，用卡尺測(cè)量2株病毒蝕斑的直徑(圖5B)，如圖5C、5DC圖1 E基因的電泳乙型腦炎病毒囊膜蛋白I176R位點(diǎn)突變株的生物學(xué)特性比較研究所示，發(fā)現(xiàn)rSA14和rJEV-EI176R 2株病毒的蝕斑形態(tài)大小基本一致，說(shuō)明突變并不影響2株病毒生長(zhǎng)形態(tài)。
2.2.2 rJEV-EI176R在不同細(xì)胞中的增殖及吸附情況分析
用rSA14病毒和rJEV-EI176R病毒分別感染BV-2、U-251、Vero和BHK-21細(xì)胞，并在2 DPI時(shí)進(jìn)行間接免疫熒光分析。如圖6A、6B所示，所有的細(xì)胞均能在NS3蛋白多克隆抗體下顯示綠色熒光，說(shuō)明rSA14和rJEV-EI176R病毒能夠感染不同來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞和不同來(lái)源的腎細(xì)胞，突變并沒(méi)有導(dǎo)致病毒失去在這4種細(xì)胞中的復(fù)制能力。同時(shí)，吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖6C)，在BV-2和U-251細(xì)胞上，rJEV-EI176R病毒的結(jié)合能力更高，且顯著高于野生型rSA14病毒(P＜0.05)。rSA14和rJEV?EI176R病毒在Vero細(xì)胞上的結(jié)合能力相似，在BHK-21細(xì)胞上，rJEV-EI176R病毒的結(jié)合能力更高，以上結(jié)果顯示，E176I-R的突變對(duì)于JEV與神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)合有顯著的影響，但對(duì)于不同種屬、不同類型的細(xì)胞具有不同的吸附特性。說(shuō)明176位點(diǎn)突變影響了病毒與不同細(xì)胞的吸附能力。
2.3 rJEV-EI176R誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞炎性水平檢測(cè)
rSA14和rJEV-EI176R病毒感染BV-2細(xì)胞后IL-6、TNF-α、IP-10的表達(dá)量具有顯著差異。如圖7A、7C所示，IL-6、TNF-α和IP-10在rSA14和rJEV?EI176R病毒的刺激下均顯著上調(diào)(P＜0.05)，證實(shí)病毒能夠引起B(yǎng)V-2細(xì)胞因子上調(diào)。同時(shí)，rSA14病毒引起IL-6、TNF-α和IP-10的表達(dá)量顯著高于rJEV-EI176R病毒(P＜0.05)，說(shuō)明rSA14病毒感染能夠?qū)е翨V-2細(xì)胞更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。
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