摘要
芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae已被證明是衰老研究領域中的重要模式生物。復制性壽命和時序壽命是用于研究酵母衰老的兩個既定范式。復制性衰老定義為單個酵母母細胞在衰老前產(chǎn)生的子細胞數(shù)量；時序衰老定義為細胞在非分裂、類靜止狀態(tài)下能夠存活的時間長度。我們開發(fā)了一種用于定量測量時序壽命的高通量方法。該方法包括在恒定溫度下，在確定的培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)細胞使其衰老。在每個時間點，從衰老培養(yǎng)物中取出一部分細胞，接種到豐富的生長培養(yǎng)基中。然后使用Bioscreen C MBR機器獲取這部分老化細胞的高分辨率生長曲線。隨后應用一種算法，根據(jù)每個時間點的生長動力學確定每個亞群中活細胞的相對比例。與其他時序壽命測定方法相比，該方法所需的時間和資源顯著減少，同時保持了可重復性和精確性。這種檢測方法的高通量性質(zhì)應允許進行大規(guī)模的遺傳和化學篩選，以識別新的長壽調(diào)節(jié)因子，以便在更復雜的生物體中進行進一步測試。
第1部分：衰老培養(yǎng)物的制備
1.將感興趣的菌株從冷凍儲備液中劃線接種到Y(jié)EPD瓊脂平板（1%酵母提取物，2%細菌蛋白胨，2%瓊脂，2%葡萄糖）上。
2.在30°C下培養(yǎng)細胞48小時或直到單菌落出現(xiàn)。
3.挑取單菌落并接種到裝有5 mL YEPD液體培養(yǎng)基（1%酵母提取物，2%細菌蛋白胨，2%葡萄糖）的試管中。
4.在30°C下培養(yǎng)過夜，同時使用搖床或滾軸鼓保持恒定振蕩。
5.用50μL過夜培養(yǎng)物接種5 mL合成完全（SC）培養(yǎng)基（表1）。通常為每個菌株制備三個SC培養(yǎng)物，以便為每個待檢菌株的壽命分析提供三次生物學重復。
6.在整個實驗期間（通常為2周或更長時間），將培養(yǎng)物置于30°C，并在滾軸鼓上保持恒定振蕩。
第2部分：獲取存活率時間點
在SC培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后，細胞應進入穩(wěn)定期，可以獲取第一個時間點。隨后的時間點應每2-3天獲取一次，至少持續(xù)兩周。對于每個時間點：
1.準備用于接種的Bioscreen 100孔蜂窩板，每個孔中加入145μL YEPD。確保至少留一個孔只加YEPD而不接種細胞，以備后續(xù)數(shù)據(jù)分析。
2.從培養(yǎng)箱中取出衰老培養(yǎng)物。
3.短暫渦旋第一個要接種到蜂窩板中的培養(yǎng)物，注意不要濺出任何培養(yǎng)液。
4.取出5μL混合均勻的培養(yǎng)物，將其移液到蜂窩板的第一個孔中。在取出5μL等分樣品前后，對每個試管的管口進行火焰消毒。
5.對每個衰老培養(yǎng)物重復此過程，務必記下每個培養(yǎng)物對應的孔位置。在整個實驗的每個后續(xù)時間點應使用相同的孔位置。
6.接種完成后，將培養(yǎng)物放回30°C培養(yǎng)箱。
第3部分：加載Bioscreen C MBR生長曲線分析儀
1.抬起蓋子露出培養(yǎng)室，取下樣品盤蓋。
2.將新接種的蜂窩板插入樣品盤（如果只讀取一個板，請使用左側(cè)插槽）。
3.蓋回樣品盤蓋，放下培養(yǎng)室蓋。
4.檢查確保熱傳遞液高于最低填充液位。如果液位低，請使用提供的熱傳遞液和1000mu L移液器添加更多液體。
5.使用Bioscreen軟件"EZExperiment"，設置以下參數(shù)以獲得適合釀酒酵母的生長曲線：
樣品數(shù)量：輸入含有培養(yǎng)基的孔數(shù)或200
濾光片：420-580nm，寬帶
溫度：30°C
實驗時長：1天，0小時，0秒
測量間隔：30分鐘
振蕩：開啟，連續(xù)振蕩，高速
6.點擊"開始"開始讀數(shù)。
第4部分：數(shù)據(jù)分析
通常，在兩周內(nèi)獲取六個時間點。時間點分別在第2、4、6、9、11和13天獲取。根據(jù)實驗設計和測試的菌株，可能需要更頻繁或更不頻繁地獲取時間點，或者超過2周。重要的是，每個時間點都以相同的順序加載蜂窩板，使得每個衰老培養(yǎng)物在每個時間點都對應相同的孔位置，這將使數(shù)據(jù)分析更加容易。
1.從Bioscreen C MBR機器獲取輸出文件。軟件"EZExperiment"將輸出Bioscreen數(shù)據(jù)為制表符分隔的文件，該文件與Microsoft Excel以及其他軟件兼容。第一列顯示實驗過程中進行OD測量的時間，隨后的列代表Bioscreen蜂窩板中的每個孔（圖1）。
圖1.Bioscreen程序"EZExperiment"的數(shù)據(jù)輸出。A列顯示進行吸光度讀數(shù)的時間。后續(xù)列代表接種了來自衰老培養(yǎng)物的細胞的蜂窩板各孔
2.刪除每列的第一個OD讀數(shù)。該讀數(shù)是"噪音"。
3.通過從每列的所有OD值中減去僅含YEPD的孔的OD值來標準化數(shù)據(jù)。這可以去除培養(yǎng)基的背景吸光度。
4.繪制生長曲線。曲線將隨年齡發(fā)生移動（圖2）。例如，通過繪制第1列（蜂窩板第1孔）在六個時間點的生長曲線，可以觀察到曲線隨時間明顯向右移動。
5.根據(jù)第2天時間點的生長動力學計算每個孔的倍增時間(delta)。用于計算倍增時間的方程為：
其中OD_{1}和OD_{2}代表連續(xù)的OD測量值，t_{1}和t_{2}是測量間隔時間。僅計算OD值在0.2到0.5之間的倍增時間。這些值的平均值即為該孔的倍增時間。僅計算OD值在0.2到0.5之間的倍增時間。這些值的平均值即為該孔的倍增時間。大多數(shù)野生型酵母菌株的倍增時間值應在85到90分鐘之間。
6.對于每個時間點，計算生長曲線相對于初始時間點（第2天）的時間偏移(Delta t)。一個簡單的方法是確定每個孔在初始時間點和每個后續(xù)時間點之間達到OD 0.3所需時間的差異。特定孔達到OD 0.3的時間可以根據(jù)對應于ln(OD)隨時間變化的線性回歸方程計算，該方程基于OD=0.3兩側(cè)的兩個時間點。
7.計算每個時間點的存活分數(shù)以生成生存曲線（圖3）。將初始時間點（第2天）定義為100%存活率。對于每個后續(xù)時間點，使用以下方程計算存活百分比：
圖3.A)使用圖1的生長數(shù)據(jù)生成的生存曲線。第2天時間點設置為100%活力點。B)同一實驗中測試的兩個菌株的最終生存曲線。這些生存曲線代表每個菌株三個生物學重復的平均活力。誤差棒代表生物學重復內(nèi)的標準差。生存曲線下的陰影區(qū)域代表菌株1的生存積分（SI）。
圖2.單個生物學重復在整個實驗過程中的生長曲線。隨著衰老培養(yǎng)物中的細胞失去活力，曲線隨時間發(fā)生明顯移動。初始時間點（第2天）與后續(xù)時間點之間的時間長度決定了該特定年齡的活力。
其中s_{n}是存活百分比，Delta t_{n}是時間偏移，delta_{n}是倍增時間。
8.根據(jù)需要為每個孔（或重復孔）生成生存曲線（圖3B），通過繪制活細胞分數(shù)（或百分比）隨年齡變化的圖。
9.計算每個孔的生存積分（SI）。SI定義為生存曲線下的面積，可以通過以下公式估算：
10.根據(jù)SI和存活數(shù)據(jù)確定重復孔的統(tǒng)計參數(shù)。常見的關注統(tǒng)計參數(shù)包括每組生物學重復的平均值、中位數(shù)和方差?？梢允褂胻檢驗或類似分析對不同實驗組和對照組的SI進行成對比較。也可能需要如4.8所述，從平均的生物學重復生成生存曲線。
第5部分：代表性結(jié)果
實驗完成后，您將繪制出生存曲線并進行足夠的數(shù)據(jù)分析，以確定幾種不同菌株或條件下的時序衰老潛力。如果操作正確，從Bioscreen C MBR機器獲得的生長曲線應類似于圖2所示，生成的生存曲線應類似于圖3所示。通常，在此所述條件下培養(yǎng)的野生型細胞的中位時序壽命約為7天。在不同菌株和某些條件下觀察到存活率存在顯著差異，例如在0.05%葡萄糖培養(yǎng)基中生長時，中位存活時間可超過30天。
注：此配方適用于二倍體BY4743菌株的營養(yǎng)缺陷型。應在合成完全培養(yǎng)基中添加5倍終濃度以補償氨基酸營養(yǎng)缺陷型。
討論
本文描述的高通量時序壽命測定法是一種有效的方法，可用于以高精度和準確度量化大量菌株的衰老潛力。與通過計數(shù)菌落形成單位來確定存活率的經(jīng)典方法相比，該方法的主要進步在于使用搖床/培養(yǎng)箱/讀板設備（如Bioscreen C MBR機器）來獲取每個時間點的高分辨率生長曲線。與低通量時序壽命測定法的直接比較表明，該方法實現(xiàn)了相當（或更好）的精度，同時顯著增加了可分析的樣品數(shù)量。該方法的主要進步在于使用搖床/培養(yǎng)箱/讀板設備（如Bioscreen C MBR機器）來獲取每個時間點的高分辨率生長曲線。與低通量時序壽命測定法的直接比較表明，該方法實現(xiàn)了相當（或更好）的精度，同時顯著增加了可分析的樣品數(shù)量，適用于衰老研究。然而，該方法可以很容易地適應替代的培養(yǎng)條件，例如預適應到每個時間點的高分辨率生長曲線。與低通量時序壽命測定法的直接比較表明，該方法實現(xiàn)了相當（或更好）的精度，同時也可以設想用于藥理學篩選目的，例如將來自化合物庫的不同化學化合物添加到衰老培養(yǎng)基中，而不是接種不同的菌株。
這里描述的方法還為壽命確定所使用的時間點提供了靈活性。如上所述，在實驗的第2、4、6、9、11和13天獲取時間點。這些時間點適用于篩選酵母ORF缺失庫以尋找壽命改變的突變體，但可能不適用于其他應用、培養(yǎng)條件或遺傳背景。但應注意，如果希望跨多個實驗進行比較，則每個實驗應使用相同的一組時間點。
在進行時序壽命實驗的過程中，我們注意到衰老培養(yǎng)物中的一部分細胞會周期性地重新進入細胞周期，這種現(xiàn)象稱為"喘息"。喘息可以觀察到一個或多個較晚時間點的生長曲線向左移動，對應于衰老培養(yǎng)物中活細胞數(shù)量的增加。除非活力已經(jīng)足夠低，以至于后續(xù)時間點不會顯著影響SI，否則發(fā)生喘息的培養(yǎng)物應從分析中剔除。
Bioscreen C MBR機器的日常維護對于獲得可重復且準確的壽命數(shù)據(jù)是必要的。必須保持熱傳遞液高于最低填充液位，并且應在每次運行機器前進行檢查。定期擦拭培養(yǎng)室內(nèi)部以去除由蜂窩板連續(xù)振蕩產(chǎn)生的灰塵也是有益的。燈泡也需要每年更換一到兩次。F1.b2錯誤消息表示燈泡光線不足。最好手頭備有幾個備用燈泡。
在過去幾年中，識別改變簡單真核生物壽命的突變體和化學物質(zhì)一直是衰老研究的驅(qū)動力。特別令人感興趣的是那些能減緩進化上不同物種衰老的干預措施。本文描述的時序壽命方法促進了對芽殖酵母基本衰老機制的理解，并識別了新的長壽因子，這些因子最終可能被證明可作為治療人類年齡相關疾病的靶點。
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