1材料與方法
1.1材料
1.1.1毒株、質(zhì)粒及細(xì)胞
rSA14：SA14株病毒的感染性克隆株，rJEV?EI176R：rSA14株病毒的E蛋白176位點(diǎn)突變?yōu)镽的毒株，2株病毒均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心周于用碩士構(gòu)建保存(Zhou et al.,2018b)。JEV感染性克隆質(zhì)粒(pACYC-JEV-SA14/U14163)由中科院武漢病毒研究所張波研究員贈(zèng)送。大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自擎科生物科技有限公司(北京)。非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero)、人星形膠質(zhì)細(xì)胞(U-251)、小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞(BV-2)、倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。
1.1.2主要試劑
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Easer、2×PrimeSTAR Max Premix、DL2000 DNA Marker購(gòu)自寶生物工程有限公司(大連)；qPCR SYBR MasterMix購(gòu)自翊圣生物科技有限公司(上海)；2×Seam‐less Cloning Mix購(gòu)自博邁德基因技術(shù)有限公司(北京)；HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG購(gòu)自博士德生物工程有限公司(武漢)；DMEM、胎牛血清購(gòu)自Gbico公司(美國(guó))；E蛋白多克隆抗體(工作濃度為1∶500,50 kD)和NS3蛋白多克隆抗體(工作濃度為1∶200,64 kD)均由本實(shí)驗(yàn)室制備保存，GAPDH抗體(工作濃度1∶5000,37 kD)購(gòu)自三鷹生物技術(shù)有限公司(武漢)，ColorMixed Protein Marker 180(10~180 kD)購(gòu)自愛(ài)博泰克生物(武漢)。
1.2方法
1.2.1 rJEV-EI176R毒株E基因擴(kuò)增
分別取500μL病毒液按病毒RNA快速抽提試劑盒說(shuō)明書(生工生物工程有限公司,上海)進(jìn)行操作得到RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中JEV SA14毒株E基因序列(GenBank No.U14163.1)，使用CE Design V1.04設(shè)計(jì)擴(kuò)增E基因引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增E基因片段的反應(yīng)體系(25μL)：cDNA 2μL，PrimeSTAR Max DNA Poly‐merase 12.5μL，上下游引物(10μmol/L)各1μL，ddH2O補(bǔ)足25μL。PCR反應(yīng)程序：98℃3 min；98℃20 s，55℃30 s，72℃20 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
1.2.2 rJEV-EI176R的生物信息學(xué)分析
將1.2.1擴(kuò)增出來(lái)的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程有限公司(上海)進(jìn)行測(cè)序，并使用DNAMAN 6軟件進(jìn)行序列比對(duì)。運(yùn)用SOPMA在線預(yù)測(cè)工具對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用ExPASy ProtParam tool在線分析軟件對(duì)E基因翻譯后的氨基酸序列進(jìn)行分析。利用Pymol2.3作圖展示蛋白的176位點(diǎn)的不同氫鍵連接方式。同時(shí)利用PolyPhen 2預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)突變的性質(zhì)。
1.2.3 rJEV-EI176R病毒株生長(zhǎng)特性測(cè)定
1.2.3.1熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
用質(zhì)粒PIRES2-EGFP-E做標(biāo)準(zhǔn)品，用分光光度計(jì)測(cè)量濃度后，依次按10倍梯度稀釋用作模板。按照引物設(shè)計(jì)原則，使用NCBI在線設(shè)計(jì)E基因的熒光定量引物(表1)，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。qP‐CR反應(yīng)體系20μL：10μL SYBR Green Mix，上下游引物(10μmol/L)各0.4μL，模板1μL，8.2μLddH2O。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche,瑞士)進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)程序：95℃2 min；95℃10 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。
1.2.3.2生長(zhǎng)曲線測(cè)定
BV-2細(xì)胞接種T75細(xì)胞瓶，待細(xì)胞鋪滿單層后，將JEV rSA14和rJEV-EI176R病毒株以相同感染復(fù)數(shù)(MOI=0.01)分別接種細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，棄去病毒液，加入20 mLDMEM(2%FBS)維持液，于感染后0、12、24、36、48、60和72 h收集500μL細(xì)胞上清液，運(yùn)用bioscreen生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定病毒E基因拷貝數(shù)，繪制病毒生長(zhǎng)曲線，比較突變株、親本株病毒在BV-2細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性差異。
1.2.3.3蝕斑試驗(yàn)
將BHK-21細(xì)胞鋪至6孔板中，待孔中細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行病毒液接種。將JEV rSA14和rJEV-EI176R病毒液按10倍梯度依次稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，并用PBS將孔中細(xì)胞潤(rùn)洗3次后接種10-4、10-5和10-6病毒混懸液，每孔200μL劑量，37℃培養(yǎng)1.5 h后棄去病毒混懸液，加入1.25%的甲基纖維素，于37℃培養(yǎng)箱放置4 d后用結(jié)晶紫染色20~30 min，用自來(lái)水輕輕沖去染液便可觀察空斑大小。
1.2.3.4 rJEV-EI176R病毒株在細(xì)胞上的增殖試驗(yàn)取無(wú)菌爬片依次放入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)成均勻的單層后，將突變株、親本株病毒以相同的感染復(fù)數(shù)(MOI=1)分別接種BV-2細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照不加病毒。分別于感染后48 h棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌3次后用4%的多聚甲醛固定0.5 h，再用PBS洗滌3次，用0.1%的曲拉通-100通透0.5 h后用PBS洗滌3次，再用IFA封閉液封閉2 h，加入500μL NS3蛋白多克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜。用Tris-HCl+Tween緩沖鹽溶液(tris-buffered saline and tween 20,TBST)洗滌后，加入500μL異硫氰酸熒光素(fluorescein iso‐thiocyanate isomer,FITC)標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育40 min，PBS洗滌4次，每次5 min。最后運(yùn)用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，用無(wú)色指甲油進(jìn)行封片。完成后，運(yùn)用奧林巴斯BX63熒光顯微鏡拍照觀察。
1.2.3.5 rJEV-EI176R病毒對(duì)細(xì)胞的吸附試驗(yàn)
BV-2細(xì)胞、U-251細(xì)胞、Vero細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，突變株與親本株病毒以相同的感染復(fù)數(shù)(MOI=10)分別接種于細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，在4℃孵育1 h，用PBS洗去未吸附的病毒，提取細(xì)胞總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照引物設(shè)計(jì)原則，使用NCBI在線設(shè)計(jì)E基因的熒光定量引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，以GAPDH為內(nèi)參基因，qPCR反應(yīng)體系20μL：10μL SYBR Green Mix，上下游引物(10μmol/L)各0.4μL，模板1μL，8.2μLddH2O。反應(yīng)程序：95℃2 min；95℃10 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。
1.2.4 rJEV-EI176R病毒誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞炎性水平差異檢測(cè)
生長(zhǎng)狀態(tài)良好的BV-2細(xì)胞生長(zhǎng)至80%~90%，分別感染突變株和親本株病毒，感染后24 h收集樣品，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。運(yùn)用qPCR檢測(cè)IL-6、TNF-α、IP-10細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。引物信息見(jiàn)表1，以GAPDH為內(nèi)參基因，用qPCR檢測(cè)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的mRNA的水平，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同1.2.3。
1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均由3次重復(fù)所得，采用Graph‐pad Prim 9.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖，采用t檢驗(yàn)分析差異顯著性。
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點(diǎn)在BV-2細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性差異——摘要、前言
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點(diǎn)在BV-2細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性差異——材料與方法
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點(diǎn)在BV-2細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性差異——結(jié)果與分析
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點(diǎn)在BV-2細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性差異——討論、結(jié)論
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