【背景】糞腸球菌(Enterococcus faecalis)是一種革蘭氏陽性兼性厭氧細(xì)菌，可以引起菌血癥、心內(nèi)膜炎、牙髓感染和尿路感染等疾病。由于抗生素耐藥性日趨嚴(yán)重，噬菌體治療已成為一種有效針對糞腸球菌感染的替代策略。
【目的】分離針對糞腸球菌的烈性噬菌體，為開發(fā)糞腸球菌噬菌體療法奠定基礎(chǔ)。
【方法】分離出針對耐萬古霉素糞腸球菌V583的噬菌體A149，通過透射電鏡觀察噬菌體的形態(tài)，測定其最佳感染復(fù)數(shù)、一步生長曲線及溫度和pH穩(wěn)定性，并進(jìn)行全基因組測序分析，以闡釋該噬菌體的基本生物學(xué)特性；測定其裂解譜和體外抑菌曲線，并進(jìn)一步通過治療耐萬古霉素糞腸球菌腸道感染小鼠模型評價其抗菌性能。
【結(jié)果】噬菌體A149的最佳感染復(fù)數(shù)為0.001，具有短尾噬菌體科(Podoviridae)的典型形態(tài)特征。噬菌體A149在較寬的溫度范圍(20?50℃)穩(wěn)定存活，60℃滴度略有下降，70℃及以上完全失活；在pH 4.0?10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定存活，在pH 11.0時滴度略有下降，pH低于3.0或高于12.0時完全失活。噬菌體A149潛伏期短(≤5 min)，暴發(fā)量高(約912 PFU/cell)，基因組不含抗生素抗性基因和毒力基因，在體外可有效抑制糞腸球菌生長達(dá)11 h，對所測試的糞腸球菌具有86.4%的裂解能力(51/59)，在小鼠腸道感染模型中可降低糞腸球菌約1.3個數(shù)量級。
【結(jié)論】本研究表明噬菌體A149對于治療糞腸球菌感染具有一定的應(yīng)用潛力，為開發(fā)糞腸球菌噬菌體防控技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
1、簡介
糞腸球菌(Enterococcus faecalis,Efs)是一種革蘭氏陽性兼性厭氧細(xì)菌，在人和各種動物的腸道中廣泛定殖，被認(rèn)為是一種常見的腸道共生菌。但Efs也可作為機(jī)會致病菌，引起菌血癥、心內(nèi)膜炎、尿道和傷口感染等疾病[1-3]。隨著抗生素的廣泛使用，Efs的耐藥性日趨嚴(yán)重，尤其是耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistant Enterococcus,VRE)的出現(xiàn)，給臨床VRE感染的治療帶來了困難[4]。研究表明腸道內(nèi)的VRE定殖可能不會引起癥狀，但可持續(xù)存在較長的時間，成為VRE的儲存庫，具有引起患者和他人感染的巨大風(fēng)險[5]。因此，開發(fā)針對VRE感染的抗生素替代方案迫在眉睫。
噬菌體是一種能夠感染并裂解細(xì)菌的病毒，可以靶向消滅特定細(xì)菌，在治療耐藥菌感染方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[6]。此外，噬菌體容易獲得，殺菌速度快，對真核細(xì)胞無害、安全，并且具有與其他抗菌藥物如抗生素、抗菌肽等的協(xié)同抗菌效應(yīng)[7-8]，是一種十分有前景的抗生素替代療法。先前的研究在城市污水、養(yǎng)殖場污水和人類糞便等各種樣本中分離出了針對Efs的多種烈性噬菌體，并且在體外和動物模型中表現(xiàn)出較好的抗菌特性[9-11]，證實(shí)噬菌體是一種有效的抗菌劑，但噬菌體的裂解特異性決定了在治療時要進(jìn)行配型，因此要篩選足夠的噬菌體毒株，建立針對特定細(xì)菌的噬菌體資源庫。本研究分離出一株針對耐萬古霉素Efs V583的烈性噬菌體，擬測定其生物學(xué)特性，完成全基因組測序并分析，評價其在體外和體內(nèi)的抗菌能力，以期為開發(fā)Efs感染的噬菌體療法奠定基礎(chǔ)。
2、結(jié)果與分析
2.1噬菌體A149的分離純化與透射電鏡觀察
以耐萬古霉素Efs V583為宿主菌從污水樣本中分離出一株噬菌體，經(jīng)過雙層平板法對噬菌體進(jìn)行3?4次純化后，將其命名為Enterococcus phage A149。如圖1A所示，噬菌體A149的噬菌斑邊界分明，周圍無暈圈。分析透射電鏡拍攝的(圖1B)，表明噬菌體A149具有典型的短尾噬菌體科(Podoviridae)的特征，頭部直徑約為46.2 nm，尾部結(jié)構(gòu)長度約28.8 nm。從形態(tài)上觀察，噬菌體A149歸屬于有尾噬菌體綱(Caudovirales)中的短尾噬菌體科。
圖1噬菌體A149的形態(tài)A：噬菌體A149形成的噬斑；B：噬菌體A149透射電鏡形態(tài)(10 000×)。
2.2噬菌體A149的最佳感染復(fù)數(shù)
將噬菌體A149與宿主菌按照10:1、1:1、0.1:1、0.01:1和0.001:1的比例分別混合后37℃振蕩培養(yǎng)6 h，雙層平板法計(jì)算各個比例下噬菌體的效價。結(jié)果如表1所示，當(dāng)MOI=0.001時，噬菌體A149生長擴(kuò)增最佳，可達(dá)1.0×1010 PFU/mL，所以0.001為噬菌體A149的最佳感染復(fù)數(shù)。
表1噬菌體A149的最佳感染復(fù)數(shù)測定
相關(guān)新聞推薦
1、煙草青枯病菌的生長曲線及對不同復(fù)合藥劑的敏感性測定（三）
3、貓皰疹病毒Ⅰ型gIgE基因缺失毒株一步生長曲線及生物學(xué)特性研究——摘要、引言