3討論
E蛋白大小約為50 kD，主要由β鏈組成，在晶格中組裝成反向平行的二聚體。成熟的病毒體上排列有90個E蛋白二聚體。E蛋白具有3個不同的結構域，中央結構域Ⅰ由九鏈混合的β-桶組成，結構域Ⅱ主要由β鏈組成，而結構域Ⅲ形成免疫球蛋白樣折疊結構(Liu et al.,2015)。E蛋白是JEV的主要結構蛋白，同時E蛋白上有多個抗原表位，能夠參與病毒感染后誘發(fā)的免疫反應。本研究測序發(fā)現(xiàn)，JEV rSA14和rJEV-EI176R的E蛋白確實存在176位點I-R的突變，分別對JEV rSA14和rJEV?EI176R的氨基酸基本序列特征分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白有500個氨基酸，同時發(fā)現(xiàn)I-R突變是脂肪族中性氨基酸到堿性氨基酸的突變。Zheng等(2018)研究發(fā)現(xiàn)，當E蛋白中某些氨基酸突變?yōu)閴A性氨基酸時，會導致毒株的毒力降低。
本研究發(fā)現(xiàn)，E176位點I-R的突變導致E蛋白等電點上升，推測是因為病毒在體外傳代的過程中會發(fā)生正電荷突變，從而使病毒更能適應體外培養(yǎng)。E蛋白的Pymol分析顯示，I-R的突變導致了176位點氫鍵結合的變化，蛋白質內部氫鍵的變化可能會導致蛋白質自身結構以及功能的變化。研究表明，JEV關鍵毒力位點上E138氨基酸的變化會導致與E47氨基酸的氫鍵連接變化，而突變E47位氨基酸同樣也會引起毒力的改變。本研究發(fā)現(xiàn)，位點突變后的病毒E蛋白二級結構中的α-螺旋、β-折疊、延伸鏈以及無規(guī)則卷曲的數(shù)量及占比均發(fā)生了改變，這些改變可改變E蛋白的空間結構，同時，蛋白質的功能作用取決于其空間結構，揭示位點突變后E蛋白的結構變化有助于闡釋病毒的減毒機制。
以上都是基于預測進行的結構分析，對于E蛋白176位點I-R的突變會導致病毒毒力減弱的機制提供部分理論基礎。E176的單一I-R突變減弱了JEV的神經(jīng)毒力，該突變病毒株rJEV-EI176R與親本病毒株rSA14在BV-2細胞中具有相似的生長特性，在BV-2細胞、U-251細胞、Vero細胞和BHK-21細胞上均觀察到綠色熒光，顯示了突變病毒對于不同細胞的適應性。在BV-2細胞中，rJEV-EI176R病毒對細胞的附著度增加，這意味著細胞在生物活動中有更多的機制來改變病毒的數(shù)量。探究病毒突變前后的生長特性有助于揭示病毒在機體中復雜的減毒機制。
在細胞因子的釋放過程中，小膠質細胞起到重要作用，小膠質細胞表達不同的模式識別受體以確認病毒，病毒入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)之后會引起細胞因子和促炎癥因子的釋放(Nayak et al.,2014)。本研究發(fā)現(xiàn)，親本株rSA14病毒相較于突變株rJEV?EI176R病毒能夠引起B(yǎng)V-2細胞釋放更多的TNF-α、IL-6和IP-10，導致更嚴重的炎癥反應。TNF-α能作為促炎癥因子誘導小膠質細胞產(chǎn)生大量細胞因子及趨化因子，作用于神經(jīng)元引起損傷；此外活化的小膠質細胞還能通過釋放谷氨酸鹽引起神經(jīng)毒性，而谷氨酸鹽的合成增多又與其釋放的TNF-α密切相關。
高水平的TNF-α能夠引起白細胞黏附內皮細胞進入炎性反應區(qū)，釋放降解酶和活性氧，清除病毒并造成組織損傷，且其分泌與病情嚴重程度相關(Jang et al.,2021)。高水平的IL-6可以促進轉化生長因子的產(chǎn)生，導致血腦屏障通透性增加，加重腦水腫(Tanaka et al.,2014)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生感染時，小膠質細胞開始活化并大量表達IP-10，介導炎性細胞浸潤，啟動或促進炎性反應進程(Qiao et al.,2022)。研究表明，JEV P3株病毒感染BV-2細胞能夠促進TNF-α、IL-6、CCL-2炎性因子的表達和分泌，這些細胞因子的大量釋放使神經(jīng)元發(fā)生間接損傷，如TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、IP-10等，能引起腦部各區(qū)細胞不同程度的形態(tài)變化(蔣蓉等,2013)。小膠質細胞活化早期對于機體有效地抵抗病毒入侵是有利的，但是隨著小膠質細胞的過度活化，產(chǎn)生的過多炎性因子會導致炎癥發(fā)生，從而造成不可逆的炎癥損傷。
4結論
本研究通過序列分析和生物信息學方法測定了重組點突變rSA14和rJEV-EI176R病毒的E蛋白基因序列、二級結構和176位點在突變前后的氫鍵連接變化，通過對E蛋白結構的預測分析，可以對E蛋白176位點I-R的突變所導致的病毒毒力減弱的機制提供部分理論基礎。同時，測定了重組點突變病毒rJEV-EI176R和親本株病毒rSA14的生長特性和誘導細胞因子表達分泌的差異。本研究對比揭示了JEV SA14病毒E蛋白176位點I-R突變后的生物學特性變化，為深入探究E蛋白功能特征和深入闡釋該位點突變后的減毒機制及疫苗研發(fā)提供了理論基礎。
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點在BV-2細胞上的生長特性差異——摘要、前言
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點在BV-2細胞上的生長特性差異——材料與方法
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點在BV-2細胞上的生長特性差異——結果與分析
乙腦病毒株囊膜蛋白I176R位點在BV-2細胞上的生長特性差異——討論、結論