摘要
抗生素的廣泛使用正在選擇多種耐藥機(jī)制，嚴(yán)重挑戰(zhàn)我們治療細(xì)菌感染的能力。耐藥細(xì)菌可以在治療用的高抗生素濃度下被選擇，但環(huán)境中存在的低得多抗生素濃度在選擇中扮演的角色仍不清楚。本文通過高靈敏度競爭實驗表明，耐藥細(xì)菌的選擇發(fā)生在極低抗生素濃度下。因此，對于三種臨床重要抗生素，藥物濃度低至敏感細(xì)菌最小抑制濃度的數(shù)百倍以下也能富集耐藥細(xì)菌，即使其初始比例極低。我們還表明，新發(fā)突變體可以在抗生素的亞最小抑制濃度下被選擇，并提供了一個數(shù)學(xué)模型預(yù)測此類突變體在敏感群體中接管的速度。這些結(jié)果為耐藥性進(jìn)化增添了新維度，并表明許多自然環(huán)境中存在的低抗生素濃度對細(xì)菌群體中耐藥性的富集和維持至關(guān)重要。
引言
抗生素代表人類最重要的醫(yī)學(xué)發(fā)明之一，但過去幾十年中，抗生素耐藥性的持續(xù)快速發(fā)展已成為社區(qū)和醫(yī)院環(huán)境中最嚴(yán)重的醫(yī)療問題之一。盡管一些耐藥基因最初很可能被選擇用于代謝功能和/或信號傳遞或保護(hù)免受競爭性抗生素產(chǎn)生菌的侵害，但近年來微生物圈中高耐藥病原菌的全球富集和傳播很大程度上由人類活動驅(qū)動，包括在人類和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)中廣泛使用和濫用抗生素。雖然很明顯治療用的高抗生素濃度可以選擇耐藥突變體，但低抗生素濃度——由于人為輸入污染自然環(huán)境（如水體或土壤）、由抗生素產(chǎn)生微生物自然產(chǎn)生、或在治療或促生長使用期間存在于某些人類/動物體腔室中——對耐藥突變體的選擇和富集的重要性仍不清楚。在藥效學(xué)模型中，通常假設(shè)耐藥細(xì)菌的選擇僅發(fā)生在敏感野生型群體的最小抑制濃度和耐藥細(xì)菌的最小抑制濃度之間的濃度范圍內(nèi)（突變體選擇窗口假說，見圖1A），且低于敏感最小抑制濃度的濃度不會抑制敏感細(xì)菌的生長，因此不具有選擇性。早期對細(xì)菌敏感性微小差異的選擇研究表明，選擇可以高效作用于微小差異以選擇耐藥性。此外，一項近期研究使用巧妙的顏色測定法定性顯示了低于最小抑制濃度的抗生素水平可以富集耐藥細(xì)菌。本文進(jìn)一步探索突變體選擇窗口假說，并如圖1A示意圖所示，針對兩種細(xì)菌物種和三種抗生素，研究預(yù)存和新發(fā)耐藥突變體因敏感對應(yīng)物生長速率的微小降低而能被選擇性富集的濃度遠(yuǎn)低于敏感最小抑制濃度的程度。
為了確定暴露于極低抗生素濃度（遠(yuǎn)低于敏感最小抑制濃度）是否會導(dǎo)致耐藥突變體富集，我們使用了幾種明確定義的大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌（變種Typhimurium LT2）突變體（文本S1中的表S1）以及三種對人類和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)高度重要的抗生素類別（四環(huán)素類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類）。使用的耐藥標(biāo)記包括Tn10dTet（賦予四環(huán)素耐藥性）、gyrA(S83L和D87N)、ΔmarR和ΔacrR突變（賦予環(huán)丙沙星耐藥性）以及rpsL(K42R)（賦予鏈霉素耐藥性），這些均在多種細(xì)菌物種的臨床分離株中發(fā)現(xiàn)。通過敏感和耐藥同基因?qū)χg的高靈敏度競爭實驗，我們顯示耐藥細(xì)菌的選擇可以發(fā)生在遠(yuǎn)低于最小抑制濃度的抗生素濃度下。最后，我們提出了一個數(shù)學(xué)模型，展示耐藥突變體在這些亞最小抑制濃度抗生素水平下如何新發(fā)出現(xiàn)并傳播。
材料與方法
細(xì)菌菌株、遺傳方法和生長條件
本研究中使用的菌株衍生自大腸桿菌MG1655和鼠傷寒沙門氏菌LT2（文中指定為鼠傷寒沙門氏菌），列于文本S1中的表S1。耐藥菌株通過P22轉(zhuǎn)導(dǎo)（鼠傷寒沙門氏菌）或P1轉(zhuǎn)導(dǎo)（大腸桿菌）將耐藥基因轉(zhuǎn)入親本菌株構(gòu)建。用于細(xì)菌生長的液體和固體培養(yǎng)基為Mueller-Hinton肉湯（Becton Dickinson,MD,USA）、Mueller-Hinton瓊脂（Mueller-Hinton肉湯補充1.5%瓊脂）和Luria-Bertani(LB)瓊脂（Sigma-Aldrich,MO,USA）。菌株在37°C生長，液體培養(yǎng)通過振蕩通氣。
生長速率測量
生長速率在37°C Mueller-Hinton肉湯中測量，有四環(huán)素存在或無，使用Bioscreen C生長曲線分析儀（Oy Growth Curves Ab Ltd,Helsinki,Finland）。每個孔接種過夜培養(yǎng)物的1000倍稀釋液，每個抗生素濃度測量進(jìn)行四次重復(fù)。培養(yǎng)物在連續(xù)振蕩下生長24小時，每4分鐘取OD600測量。計算基于0.02至0.1之間的OD600值，其中生長觀察為指數(shù)期。敏感菌株(DA6192)和耐藥菌株(DA17822)在單獨實驗中生長，相對生長速率計算為衍生生長速率除以同一菌株無抗生素生長時的生長速率。
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