1.2方法
1.2.1引物設計及合成
運用同源重組和質(zhì)粒回補的方法構(gòu)建布魯氏菌BspE基因缺失株和回補株。在NCBI搜索牛種布魯氏菌A19株的第一條染色體的全基因組序列(GenBank登錄號:NZ_CP030751.1)，使用Snapgene軟件設計BspE基因上、下游同源臂引物、缺失株鑒定引物、包含啟動子區(qū)域的BspE上游引物及攜帶flag和去掉終止子的下游引物。引物信息見表1，引物均由擎科生物科技公司合成。
1.2.2布魯氏菌BspE基因缺失株和回補株構(gòu)建
通過同源重組方法結(jié)合電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建布魯氏菌BspE基因缺失株(圖1A)，通過質(zhì)粒回補方法結(jié)合電轉(zhuǎn)化法構(gòu)建布魯氏菌BspE基因回補株(圖1B)。
1.2.3目的基因PCR擴增
利用引物BspE-up-F/R、BspE-down-F/R，以滅活的牛種布魯氏菌A19菌液為模板，對BspE基因上、下游同源臂進行擴增;利用引物BspE-F/R、Kana-F/R及pBB-F/R，以滅活的牛種布魯氏菌A19菌液、pET-28a(+)和pBBR1MCS質(zhì)粒為模板，分別擴增BspE、kana基因片段及pBB復制子片段。PCR反應體系25μL:牛種布魯氏菌A19菌液3μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，Primer Star Max Premix 12.5μL，ddH?O 7.5μL。PCR反應程序:98℃預變性10min;98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán);72℃延伸10min;4℃保存。反應完成后膠回收DNA片段，于-20℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.4融合PCR擴增
將BspE基因上、下游同源臂片段按照1:1比例混合后作為模板，利用引物BspE-up-F、BspE-down-R，通過融合PCR技術進行擴增;將BspE和kana基因片段按照1:1比例混合后作為模板，利用引物BspE-F、Kana-R，通過融合PCR技術進行擴增。PCR反應體系和程序按1.2.3進行。反應完成后對DNA片段進行膠回收，于-20℃保存?zhèn)溆谩?
1.2.5重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定
使用ClonExpress一步法，分別將融合的BspE基因上、下游同源臂片段與pUC19-SacB質(zhì)粒、融合后的BspE和kana基因片段與pBB復制子片段進行反應，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC19-△BspE和pBB-BspE。反應體系20μL:融合DNA片段8μL，pUC19-SacB/pBB-BspE 2μL，2×ClonExpress Mix 10μL。將反應體系在50℃水浴鍋中孵育45min后進行轉(zhuǎn)化，篩選陽性菌落。分別以BspE-up-F、BspE-down-R和BspE-F、Kana-R為引物進行菌液PCR檢測，陽性菌液送擎科生物科技公司進行測序鑒定。
1.2.6布魯氏菌效應蛋白BspE基因缺失株和回補株的構(gòu)建及篩選
將質(zhì)粒pUC19-△BspE電轉(zhuǎn)至牛種布魯氏菌A19感受態(tài)細胞，經(jīng)卡那抗性和蔗糖壓力篩選后進行菌液PCR鑒定，篩選BspE基因缺失株A19△BspE。將提取的pBB-BspE質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至A19△BspE株中，經(jīng)卡那抗性篩選后進行Western blotting鑒定，篩選BspE基因回補株A19C△BspE。
1.2.7布魯氏菌生長特性分析
將牛種布魯氏菌A19和鑒定正確的A19△BspE和A19C△BspE進行平板劃線，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，挑取單個菌落接種于15mL TSB培養(yǎng)液中，37℃、180r/min恒溫搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期。再次分別將牛種布魯氏菌A19、A19△BspE和A19C△BspE按照1:100比例接種于含100mL TSB培養(yǎng)液的錐形瓶中，37℃、180r/min恒溫搖床培養(yǎng)，每隔8h取1mL菌液通過微生物生長曲線分析儀檢測菌液D600mm值，直至72h。
1.2.8胞內(nèi)增殖試驗
為檢測BspE基因?qū)Σ剪斒暇麅?nèi)生存的影響，按照5×10?/mL將RAW264.7細胞接種于24孔板中，培養(yǎng)12h后，將計數(shù)的牛種布魯氏菌A19、A19△BspE與A19C△BspE按感染復數(shù)(MOI)為1:200侵染細胞，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)4h。用PBS洗3次，加入含50μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)液，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中殺菌1h。用PBS洗3次，加入含25μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)液，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在0、6、12、24和48h后棄培養(yǎng)液，用PBS洗3次，加入0.5%Triton X-100，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱裂解細胞10min以釋放細菌，通過10倍梯度稀釋涂布于TSA平板上進行菌落計數(shù)。
1.2.9細菌黏附試驗
細胞接種、攻菌方法同1.2.8，MOI為100。攻菌后在37℃、5%CO?孵育1h，用無菌PBS清洗3次，加0.5%Triton X-100裂解細胞，進行10倍梯度稀釋涂板計數(shù)。
1.2.10細菌入侵試驗
細胞接種、攻菌、殺菌及維持培養(yǎng)同1.2.8。用含25μg/mL慶大霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)1h后，加0.5%Triton X-100裂解細胞，進行10倍梯度稀釋涂板計數(shù)。
1.2.11間接免疫熒光試驗
為檢測效應蛋白BspE在小鼠RAW264.7細胞中的分布情況，將RAW264.7細胞按2×10?/mL接種于帶有細胞爬片的24孔板中，攻菌、殺菌及維持培養(yǎng)方法同1.2.8，將未感染菌的細胞作為空白對照。感染24h后，用PBS洗3次，加4%多聚甲醛固定液，靜置30min，用PBS洗3次，5min/次;加0.5%Triton X-100，室溫下靜置20min，使細胞穿孔，用PBS洗3次，5 min/次;加入3%BSA封閉液，37℃孵育30 min;棄掉封閉液，直接加入1:100稀釋的鼠抗布魯氏菌血清和兔抗flag抗體，4℃過夜孵育，次日在37℃復溫15min，用PBS洗3次，5min/次;加入驢抗鼠和驢抗兔二抗，37℃避光孵育1h，用PBS洗3次，5min/次;加1:1000稀釋的DAPI，37℃避光孵育10min，用PBS洗3次，5min/次;滴入抗熒光淬滅劑并封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察。
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
每組試驗重復3次，試驗結(jié)果以平均值±標準差表示。使用GraphPad Prism9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，并以t檢驗進行差異顯著性分析。P<0.05表示差異顯著。
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