腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）屬于革蘭氏陰性菌，適宜低溫下生長(zhǎng)，能產(chǎn)生H2S、TMA、CH4SH和（CH3）2S等揮發(fā)性物質(zhì)，腐敗潛力強(qiáng)，被確認(rèn)為有氧冷藏海水魚的特定腐敗菌（Specific spoilage organisms，SSO）。研究者針對(duì)水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌生態(tài)特性、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、貨架期預(yù)測(cè)、靶向抑制和抑菌機(jī)制等進(jìn)行了探究，研究了環(huán)境因子對(duì)大黃魚腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)影響的計(jì)數(shù)法。研究了復(fù)合生物保鮮劑對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑菌機(jī)理。水產(chǎn)品在加工、銷售、流通和貯藏過程中微生物受內(nèi)在和外在因子的影響，特別在運(yùn)輸過程中溫度易產(chǎn)生波動(dòng)，多因子交互作用下可能產(chǎn)生拮抗和協(xié)同作用。
通過設(shè)置“抑菌柵欄”和改變柵欄強(qiáng)度達(dá)到抑制微生物的作用。采用微生物生長(zhǎng)／非生長(zhǎng)（Growth/no growth，N/NG）界面模型可定量分析不同柵欄下目標(biāo)微生物生長(zhǎng)的可能性（或概率），獲得不同環(huán)境因子下的生長(zhǎng)／非生長(zhǎng)信息，定量調(diào)節(jié)水產(chǎn)品內(nèi)外環(huán)境，達(dá)到殺滅或抑制作用。微生物生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型常采用Logistic回歸法，食品中微生物生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界限模型多為致病菌模型，如單增李斯特菌、黃曲霉菌和蠟樣芽孢桿菌等模型，用于控制微生物毒素的產(chǎn)生，保障食品安全。目前食品腐敗菌模型的開發(fā)相對(duì)較少，如乳酸菌和結(jié)合酵母等，通過定量控制微生物的生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Artificial neural Network，ANN）在食品加工工程中已廣泛應(yīng)用，其中PNN（Probabilistic Neural Network）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法適用于生長(zhǎng)／非生長(zhǎng)模型的建立，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和訓(xùn)練速度快的特點(diǎn)，可利用線性學(xué)習(xí)算法實(shí)現(xiàn)非線性學(xué)習(xí)算法的功能，對(duì)微生物生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)數(shù)據(jù)進(jìn)行快速分類。采用Logistic回歸法和PNN人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法構(gòu)建aw、pH及鹽分交互作用下腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型未見研究報(bào)道。
本文選取魚源腐敗希瓦氏菌為研究對(duì)象，研究室溫（25℃）條件下pH、aw及鹽分（NaCl）對(duì)菌株腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)概率的交互影響，采用二階線性Logistic回歸方程擬合和PNN人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法構(gòu)建環(huán)境因子交互作用下生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)界面模型。旨在評(píng)估魚源腐敗希瓦氏菌在pH、aw和鹽分范圍的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，開發(fā)高效抑菌及定量評(píng)估方法，為保障海產(chǎn)品鮮度和品質(zhì)安全提供支持。
1材料與方法
1.1試驗(yàn)材料
菌株D1從低溫有氧貯藏大黃魚貨架期終點(diǎn)時(shí)分離，16SrRNA測(cè)序鑒定為腐敗希瓦氏菌（序列號(hào)：KY786336），4℃保藏。
1.2試驗(yàn)試劑及儀器
胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）；胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）；1.0%鹽酸；1.0%氫氧化鈉；甘油和氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海）。
水分活度儀（AW LAB-Touch PMB35），大昌華嘉商業(yè)中國(guó)有限公司；pH計(jì)（pHS-3C），上海雷磁儀器廠；微生物生長(zhǎng)測(cè)定儀（Bioscreen C），芬蘭；潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FB），上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；低溫培養(yǎng)箱（MIR-153），日本三洋公司。
1.3培養(yǎng)基制備
采用TSB作為培養(yǎng)基。25℃時(shí)，pH≤5.0或aw≤0.920或NaCl≥12%時(shí)，腐敗希瓦氏菌不生長(zhǎng)，海水平均鹽度為3.5%，故交互試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)如表1所示，選取均分水分活度0.90，0.92，0.94，0.96作為訓(xùn)練集建立模型，為避免誤差選擇具有代表性的相同水分活度0.91為驗(yàn)證集，計(jì)120種工況，每種重復(fù)4次和1個(gè)空白平行。通過滅菌甘油調(diào)節(jié)水分活度，0.1 mol/L稀鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。
表1腐敗希瓦氏菌pH，aw和鹽分交互試驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.4菌懸液制備與接種
菌株活化：取腐敗希瓦氏菌接種于無菌營(yíng)養(yǎng)肉湯中，振蕩30 s，25℃培養(yǎng)24 h，劃線得到單菌落。
菌株接種：把調(diào)節(jié)過pH、aw和鹽分的TSB經(jīng)121℃滅菌后接入100孔微孔板，每孔180μL，取105CFU/mL的菌懸液20μL，最終接種液濃度為4.5 lgCFU/mL，接種入孔，每個(gè)條件4組平行，1個(gè)空白，25℃培養(yǎng)，每隔1 h測(cè)定其OD600nm值，測(cè)試周期為7 d。
1.5生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)邊界確定
當(dāng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，微孔中出現(xiàn)明顯沉淀物或混濁，OD值高于空白3倍則判定為生長(zhǎng)，判定為生長(zhǎng)時(shí)，取微孔中培養(yǎng)液100μL涂布于TSA平板上，驗(yàn)證菌株是否仍為純菌株。當(dāng)OD值1～3倍之間時(shí)，涂布TSA平板驗(yàn)證，若平板出現(xiàn)典型菌落，
菌數(shù)與初始菌量差＞0.5 lgCFU/mL時(shí)，則判定為生長(zhǎng)。每種情況下的生長(zhǎng)概率由重復(fù)孔的生長(zhǎng)情況計(jì)算獲得，如4孔中2孔生長(zhǎng)則該情況下生長(zhǎng)概率為50%。
1.6建立生長(zhǎng)/非生長(zhǎng)模型
1.6.1 Logistic模型建立依據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取90例數(shù)據(jù)為訓(xùn)練集用來建立模型，Logistic模型如式1所示：
式中：p——生長(zhǎng)／非生長(zhǎng)概率；bi（0～9）——擬合參數(shù)；Na——鹽分（V/V）。
1.6.2 PNN人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立PNN人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型是基于Bayes分類規(guī)則與Parzen窗的概率密度函數(shù)估計(jì)方法發(fā)展而來的一種并行算法。
將試驗(yàn)數(shù)據(jù)歸一化后，依據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取90例數(shù)據(jù)，鹽分、pH和aw作為三維向量進(jìn)入輸入層，在Matlab軟件中進(jìn)行訓(xùn)練，輸出層神經(jīng)元設(shè)定為1，結(jié)構(gòu)概率≤0.5的記作1類非生長(zhǎng)，＞0.5的記作2類生長(zhǎng)。訓(xùn)練完成后剩余30例數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證輸入，驗(yàn)證訓(xùn)練模型的準(zhǔn)確性。
1.7模型擬合優(yōu)度及預(yù)測(cè)力評(píng)價(jià)
1.7.1擬合優(yōu)度評(píng)價(jià)Logistic模型擬合優(yōu)度采用似然比測(cè)試（-2lnL，the likehood test）、赤池信息準(zhǔn)則（AIC=-2lnL+2k，Akaike's information criterion）、Hosmer-Lemeshow測(cè)試（HL）和R2-Nagelkerke進(jìn)行評(píng)價(jià)。-2lnL、AIC常用于模型擬合優(yōu)度評(píng)判，數(shù)值越小，證明擬合效果越好。Hosmer-Lemeshow用于評(píng)估模型任意數(shù)量的連續(xù)與分散的解釋變量的擬合優(yōu)度，數(shù)值越小，擬合效果越好，但無法將標(biāo)準(zhǔn)偏差納入考慮，一個(gè)不理想的預(yù)測(cè)值亦可能導(dǎo)致該值的升高，故常結(jié)合R2-Nagelkerke值一起考慮，R2-Nagelkerke值主要反映了解釋變量與響應(yīng)變量間的關(guān)系，其值越接近1，擬合優(yōu)度越好。
1.7.2預(yù)測(cè)力評(píng)價(jià)Logistic模型與PNN人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)力采用C-matrix獲得的一致率（Fraction correct，F(xiàn)C）和假陽(yáng)性率（False alarm rate，F(xiàn)AR）進(jìn)行比較，F(xiàn)C值越接近于100%說明預(yù)測(cè)效果越好，F(xiàn)C值為預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的吻合度，F(xiàn)AR為假陽(yáng)性錯(cuò)判率，可作為模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度的參考。公式如下：
1.8模型驗(yàn)證
選取30例數(shù)據(jù)為驗(yàn)證集對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，帶入建立的Logistic模型與PNN人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型中，采用FC%和FAR%模型驗(yàn)證的準(zhǔn)確率和預(yù)測(cè)力進(jìn)行評(píng)價(jià)。
1.9數(shù)據(jù)分析
使用SPSS18.0（美國(guó)IBM公司）對(duì)模型進(jìn)行擬合模型，通過Origin9.0（美國(guó)OriginLab公司）繪制生長(zhǎng)／非生長(zhǎng)曲線，PNN人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建立采用MatlabR2016b進(jìn)行建模。
室溫條件下pH、aw及鹽分對(duì)腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)概率的交互影響（一）
室溫條件下pH、aw及鹽分對(duì)腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)概率的交互影響（二）
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