2結(jié)果
2.1茄病鐮刀菌抗性菌株的分離與篩選
從采集的23份根際土壤中共分離純化得到菌株343株，通過(guò)與黃瓜茄病鐮刀菌的對(duì)峙培養(yǎng)，篩選出抑菌率在60%-70%的菌株5株（表1），50%-60%的菌株59株，192株菌株對(duì)茄病鐮刀菌抑菌效果不佳。對(duì)抑菌率在50%以上的菌株編號(hào)并進(jìn)行復(fù)篩。
表1分離菌株對(duì)黃瓜茄病鐮刀菌的抑菌情況
復(fù)篩結(jié)果表明，菌株XY-1、XY-13、XY-53對(duì)茄病鐮刀菌生長(zhǎng)有明顯的抑制效果，抑菌率分別為65.90%、66.13%和60.83%（表2）。
表2菌株培養(yǎng)上清液對(duì)黃瓜茄病鐮刀菌的抑制效果
注：同列不同小寫(xiě)字母表示數(shù)據(jù)差異顯著（P<0.05）
2.2茄病鐮刀菌拮抗菌株的鑒定
復(fù)篩得到的3株拮抗效果最好的菌株在NA平板上均長(zhǎng)勢(shì)良好。菌落形態(tài)鑒定如表3。3株拮抗菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體呈桿狀，產(chǎn)橢圓形芽孢，如圖1所示。
表3拮抗菌的形態(tài)及特征
圖1菌株XY-1、XY-13及XY-53的菌落形態(tài)（A）、革蘭氏（B）以及芽孢染色（C）形態(tài)
拮抗菌XY-1、XY-13和XY-53菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明（表4），3個(gè)菌株在接觸酶、氧化酶、明膠液化、乙酰甲基甲醇（V-P）、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，在甲基紅試驗(yàn)中呈陰性，XY-1、XY-13在淀粉水解試驗(yàn)中呈陽(yáng)性，XY-53在淀粉水解試驗(yàn)呈陰性；抗病促生測(cè)試結(jié)果表明（表4），3個(gè)菌株均具有溶磷、固氮和產(chǎn)生ACC脫氨酶的能力，可以產(chǎn)生蛋白酶，均無(wú)解鉀能力，不能產(chǎn)生鐵載體、幾丁質(zhì)酶、果膠酶和纖維素酶。
表4 XY-1、XY-13、XY-53的生理生化特征及抗病促生特性測(cè)試結(jié)果
注：“+”表示陽(yáng)性；“-”表示陰性
將3株拮抗菌的基因序列用BLAST比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2-A），結(jié)果顯示XY-1與解淀粉芽孢桿菌（登錄號(hào)：ON287217.1）核苷酸序列比對(duì)相似度為99%，XY-13與解淀粉芽孢桿菌（登錄號(hào)：MK521053.1）核苷酸序列比對(duì)相似度為98%，XY-53與枯草芽孢桿菌（登錄號(hào)：641205.1）核苷酸序列比對(duì)相似度為100%；再構(gòu)建gyrA、ropA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2-C和圖2-D），結(jié)果顯示XY-1與解淀粉芽孢桿菌（MK789290.1）核苷酸序列比對(duì)相似度為100%,故確定菌株XY-1為解淀粉芽孢桿菌；XY-13與解淀粉芽孢桿菌核苷酸（AJ832121.1）序列比對(duì)相似度為98%，故確定菌株XY-13為解淀粉芽孢桿菌；XY-53與枯草芽孢桿菌（登錄號(hào)：MW287082.1）序列比對(duì)相似度為100%，故確定菌株XY-53為枯草芽孢桿菌。
圖2菌株XY-1、XY-13及XY-53的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和特異性引物PCR電泳圖
A：基于16S rDNA基因序列構(gòu)建XY-1、XY-13及XY-53菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；B：XY-1、XY-13及XY-53菌株的ropA、gyrA基因序列的凝膠電泳；C：基于gyrA基因序列構(gòu)建XY-1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；D：基于ropA基因序列構(gòu)建XY-13、XY-53菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
2.3抗性菌株的促生效果
盆栽試驗(yàn)表明，3株菌均可顯著促進(jìn)黃瓜幼苗株高、莖粗、葉綠素含量、地上部鮮重、地上部干重的增加，菌株XY-53的促生效果最好，XY-13次之（表5）。與對(duì)照（清水）相比，菌株XY-53處理后幼苗株高、莖粗、葉綠素含量、地上部鮮重、地上部干重、地下部干重均顯著增加，分別增加了34.94%、7.91%、43.43%、51.52%、46.27%和37.70%。
表5菌株XY-1、XY-13、XY-53對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的影響
注： CK1、XY-1、XY-13、XY-53是不同的處理方式，分別代表黃瓜幼苗接種清水、XY-1、XY-13、XY-53。同列不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著（n=4，P< 0.05），下同
2.4抗性菌株的防病效果
將3株對(duì)黃瓜茄病鐮刀菌拮抗效果較好的菌株進(jìn)行了盆栽防效試驗(yàn)。結(jié)果（表6，圖3）表明，3株芽孢桿菌對(duì)黃瓜根腐病均有較好的防控效果。不同菌株發(fā)酵液中菌含量不同時(shí)，防病效果差異明顯，防效隨接種濃度的增加而升高。其中枯草芽孢桿菌XY-53原液處理的防病效果最佳，為82.86%，解淀粉芽孢桿菌XY-1和XY-13分別為65.12%%、72.09%。
表6菌株XY-1、XY-13、XY-53對(duì)黃瓜根腐病的防治效果
圖3菌株XY-1、XY-13、XY-53對(duì)黃瓜根腐病的盆栽防控效果
植株生長(zhǎng)特性測(cè)定結(jié)果表明（表7），接種XY-1、XY-13、XY-53發(fā)酵液后再接種病原菌，黃瓜幼苗的株高、莖粗、葉綠素含量、地上部鮮重均顯著高于CK2（只接種病原菌）。由此可見(jiàn)，施用芽孢桿菌XY-1、XY-13及XY-53菌種發(fā)酵液不僅能有效防控黃瓜苗期根腐病，還可以促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)。
表7菌株XY-1、XY-13和XY-53對(duì)黃瓜的促生效果
注： CK2、T1、T2、T3是不同的處理方式，CK2、T1、T2、T3分別代表黃瓜幼苗分別接種了清水、XY-1、XY-13、XY-53
3、討論
植物根際存在大量的有益微生物，可以促進(jìn)植株生長(zhǎng)，提高植株抵御不良脅迫的能力。芽孢桿菌屬菌株已被廣泛接受為對(duì)抗多種植物病原體的有效BCAs，可作為殺菌劑防治黃瓜根腐病的替代選擇。
本研究中，3株芽孢桿菌均表現(xiàn)出很好的BCAs潛力和PGPR活性。平板對(duì)峙試驗(yàn)中，解淀粉芽孢桿菌XY-1、XY-13和枯草芽孢桿菌XY-53可顯著降低茄病鐮刀菌的徑向生長(zhǎng)，這歸因于芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶類(lèi)物質(zhì)，抑制了病原菌的增殖，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌FJAT-14262產(chǎn)生的抗真菌脂肽可以抑制平板中尖孢鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)、解淀粉芽孢桿菌E3分泌的脂肽類(lèi)物質(zhì)可以抑制茄病鐮刀菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，芽孢桿菌FR9產(chǎn)生的蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶A）可以抑制病原菌的生長(zhǎng)，解淀粉芽孢桿菌LZN01分泌的抗菌物質(zhì)可以抑制鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)。生防菌株能否在植物根際或根部有效定殖是決定根部病害防治成功的關(guān)鍵一步。盆栽試驗(yàn)中，芽孢桿菌XY-1、XY-13和XY-53對(duì)黃瓜根腐病的防病效果隨著接種濃度的升高而增加，濃度為108 CFU/mL時(shí)防效最高，與前人的研究結(jié)果一致，因?yàn)檩^高的菌液濃度使接種后位于根際的芽孢桿菌擁有較大的定殖基數(shù)，為產(chǎn)生更多的拮抗物質(zhì)、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)空間營(yíng)養(yǎng)進(jìn)而有效防治根腐病奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，而盆栽試驗(yàn)中，接種病原菌后的幼苗葉片黃化，則是根腐病發(fā)病的癥狀之一，接種高濃度菌液的幼苗黃化程度弱于低濃度菌液，而低濃度菌液幼苗處理之間黃化差異不顯著，這表明高濃度菌液對(duì)黃瓜根腐病的防效高于低濃度菌液。
PGPR定殖在植物根際，可以促進(jìn)植株生長(zhǎng)，3株芽孢桿菌在單獨(dú)施用以及病原菌侵染條件下均可以促進(jìn)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)，這表明3個(gè)菌株均能很好地定殖于植株根際，在根部占據(jù)有利生態(tài)位點(diǎn)，為防控黃瓜根腐病、促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)提供了有利條件。在促生試驗(yàn)中，芽孢桿菌XY-1、XY-13和XY-53均可以顯著促進(jìn)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為對(duì)幼苗株高、莖粗、葉綠素含量和地上部生物量的顯著促進(jìn)。此外，XY-1、XY-13和XY-53可以在有效防控黃瓜根腐病的同時(shí)促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，分析其原因是菌株抗生作用和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性共同發(fā)揮作用的結(jié)果，與前人發(fā)現(xiàn)抗性芽孢桿菌可以防治土傳病害，同時(shí)促進(jìn)植株生長(zhǎng)的結(jié)果一致。菌株的促生效果與其具有的溶磷能力、固氮能力和ACC脫氨酶活性有關(guān)。芽孢桿菌可以通過(guò)產(chǎn)生拮抗代謝物，如抗生素、降解酶、ACC脫氨酶、揮發(fā)性化合物和鐵載體等參與拮抗菌的生物控制，間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)，或通過(guò)溶解磷酸鹽、生物固氮等提高植物根際養(yǎng)分的可利用性，直接促進(jìn)作物生長(zhǎng)，研究結(jié)果表明接種固氮、溶磷菌株可以增加土壤中速效氮、磷、鉀的含量、改善土壤理化性質(zhì)，促進(jìn)作物的生長(zhǎng)，含有ACC脫氨酶的根際細(xì)菌能促進(jìn)植株生長(zhǎng)。
芽孢桿菌XY-1、XY-13和XY-53具有良好的防病促生效果，為黃瓜茄病鐮刀菌根腐病的生物防治提供了理論依據(jù)，也為芽孢桿菌的產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)提供了菌種資源。但對(duì)其防病效果的廣譜性、及其在根際定殖的動(dòng)態(tài)規(guī)律與代謝產(chǎn)物的研究、發(fā)酵工藝優(yōu)化有待進(jìn)一步明確，以便全面的發(fā)掘XY-1、XY-13和XY-53的防治潛力，進(jìn)而研發(fā)出多功能的芽孢桿菌制劑。
4、結(jié)論
分離得到解淀粉芽孢桿菌XY-1、XY-13，枯草芽孢桿菌XY-53。接種XY-1、XY-13、XY-53可以顯著促進(jìn)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)，對(duì)黃瓜幼苗株高、莖粗、葉綠素含量、生物量累積有顯著增加效果，對(duì)黃瓜根腐病防效達(dá)65.12%、72.09%和82.86%。XY-1、XY-13和XY-53，特別是XY-53可作為防控黃瓜苗期茄病鐮刀菌根腐病、促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)有潛力的生物防治資源。
淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌抑制茄病鐮刀菌效果顯著，可促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)（一）
淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌抑制茄病鐮刀菌效果顯著，可促進(jìn)黃瓜幼苗生長(zhǎng)（二）
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