2.2鼠李糖乳桿菌Probio-M9連續(xù)傳代過程中比較基因組學分析
2.2.1基因組信息本研究中不同代時菌株組裝的基因組信息如表3所示，鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始菌株基因組大小3.00 Mb，GC含量46.76%。傳代過程中菌株的平均基因組大小為（3.00±0.002）Mb，GC含量（46.76±0.007）%。
表3 5個不同代時15株菌基因組信息
2.2.2系統(tǒng)發(fā)育分析
本研究中利用系統(tǒng)發(fā)育樹來描述傳代過程中菌株的進化關系，進而判斷菌株在連續(xù)培養(yǎng)過程中的穩(wěn)定性。以鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698作為外群，使無根樹轉為有根樹，鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始基因組為參考基因組，使用Soapsnp方法得到的15個菌株的SNP位點連成序列，通過鄰接法（NJ法）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。
如圖4所示，系統(tǒng)發(fā)育樹共分為兩個分支，5個代時的15株菌聚在同一系統(tǒng)發(fā)育分支，親緣關系極近，且明顯與外群基因組處于不同分支。
圖4基于SNP位點構建系統(tǒng)發(fā)育樹
2.2.3平均核苷酸一致性分析
平均核苷酸一致性（ANI）是在核苷酸的水平上，用以比較兩個基因組之間親緣關系的常用指標，其特點是對于近緣種群的區(qū)分度更高。在比較基因組學分析中，常用ANI評估基因組間的多態(tài)性和相似性，當ANI大于95%時，即表示為同一個種。通過計算鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始基因組和15株不同代時菌株基因組間的ANI值，并繪制成熱圖。
由圖5可知，鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始基因組和15株不同代時菌株基因組，兩兩菌株間的ANI值均在99.00%，菌株之間表現(xiàn)出極高的相似性，且高于種間鑒定標準，可準確鑒定為同一亞種，表明連續(xù)培養(yǎng)100代過程中菌株均屬同一亞種即鼠李糖乳桿菌Probio-M9。
圖5基于5個不同代時基因組序列繪制ANI熱圖
2.2.4共線性分析
共線性可用來描述同一染色體上基因的位置關系，對不同的基因組間通過基因排列順序對其共同祖先進行探索，基因組相關性越高則其中同源序列一致性越高。本研究選取鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始基因組序列作為參考，利用Mauve軟件對15株不同代時基因組進行共線性分析。
結果如圖6所示，15株不同代時培養(yǎng)的菌株與鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始基因組的共線性較好，具有極高的相似性，每個基因組中均未檢測到基因片段的倒位。與鼠李糖乳桿菌Probio-M9比較，A50-3和A75-2有大片段缺失，約為15 kb，主要包含整合酶家族蛋白、組氨酸激酶、核糖核酸酶、假設蛋白、tuf、cobB_1和ATP結合酶蛋白等基因。其余菌株均有小片段缺失，且基因缺失位置隨機。
圖6基于15株不同代時序列組裝結果與鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始基因組的共線性分析
2017年，Zhang等發(fā)現(xiàn)一種由asp23基因編碼的堿性休克蛋白參與了干酪乳桿菌Zhang對慶大霉素的適應性，從蛋白質組學對其適應性機制進行探究，通過比較含有慶大霉素的培養(yǎng)基中生長的asp23基因缺失突變體及其親本菌株的蛋白質組，發(fā)現(xiàn)與asp23突變株相比，一些膜相關蛋白在親本菌株中顯著上調，表明asp23編碼的堿性休克蛋白能夠通過調節(jié)細胞膜蛋白來適應慶大霉素的環(huán)境脅迫。本研究中15株不同代時培養(yǎng)的菌株均有一定的基因片段缺失現(xiàn)象發(fā)生，因此對于本研究中缺失片段所表達的基因功能還有待進一步研究。
2.2.5 SNP突變位點以鼠李糖乳桿菌Probio-M9為參考菌株，利用Soapsnp軟件對15株不同代時鼠李糖乳桿菌Probio-M9菌株進行SNP位點識別，同時使用Samtools軟件對測序數據檢測到的突變位點進行過濾，剔除假陽性結果，結果見表4。
表4 15株不同代時菌株提取的SNP突變位點及注釋信息
以鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始菌株基因組為參照，鼠李糖乳桿菌Probio-M9在連續(xù)培養(yǎng)100代時的不同代時菌株中共發(fā)現(xiàn)16個SNP位點，SNP位點分布及功能如表4所示，包括6個同義突變和4個非同義突變，6個位于非編碼區(qū)。非同義突變主要位于編碼酪氨酸受體激酶YwqD（Tyrosine-protein kinase）和假設蛋白（Hypothetical protein）的基因上。根據突變位點對其穩(wěn)定性進行分析發(fā)現(xiàn)，連續(xù)培養(yǎng)100代過程中高頻突變數量較少，檢測到2個SNP，且首次發(fā)生在第0代基因組與參考基因組之間，一旦建立將穩(wěn)定遺傳。菌株低頻突變檢測到的個數均小于21。研究表明，SNP個數小于21時，可將其鑒定為同一物種。不同代時15株菌所識別到的SNP位點均小于21個，表明15株不同代時菌株可鑒定為同一物種。
5個代時菌株SNP位點隨機產生，從0代到25代、25代到50代、50代到75代、75代到100代的菌株中，均未發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定存在的突變位點。表明鼠李糖乳桿菌Probio-M9在連續(xù)傳代100代時過程中，遺傳穩(wěn)定性良好。
2.2.6碳水化合物活性酶注釋
碳水化合物活性酶數據庫（CAZy）是物質對碳水化合物及其衍生物的合成及分解的酶類數據資源庫。本研究通過該數據庫對鼠李糖乳桿菌Probio-M9碳水化合物活性酶功能基因進行分析，在基因組水平觀察鼠李糖乳桿菌Probio-M9菌株在連續(xù)培養(yǎng)100代時對碳水化合物利用能力的穩(wěn)定程度。
如圖7所示，從15株不同代時基因組中共注釋到6大類碳水化合物活性酶的68個小類基因家族，主要以GHs（糖苷水解酶）和GTs（糖苷轉移酶）酶類的含量最為豐富。大部分基因家族在不同代時無顯著差異，雖然極個別菌株注釋到的酶類存在不一致情況，但不會穩(wěn)定遺傳，且總體碳水化合物利用情況相同，遺傳穩(wěn)定性較好，與表型中不同代時碳水化合物利用能力相同的結果相吻合。
圖7不同代時菌株碳水化合物活性酶注釋
3、結論
遺傳穩(wěn)定性即子代產生的性狀與親本擁有相同的基因型。在生物進化過程中，遺傳變異會經常出現(xiàn)，如不嚴格進行人工選擇，就會導致菌種的衰退，從而導致菌種在生產應用過程中出現(xiàn)低產、不穩(wěn)定現(xiàn)象。研究表明，菌株在培養(yǎng)及使用過程中，因保藏方法不同、培養(yǎng)基選擇、傳代代次和人工操作等原因會導致菌種出現(xiàn)衰退現(xiàn)象。早在1983年，Clements等發(fā)現(xiàn)不同批次用相同方法制備的乳桿菌在治療腹瀉的效果上存在顯著的差異。引發(fā)了人們對于遺傳穩(wěn)定性的關注。
近年來，益生菌愈加的受大眾歡迎，而在選擇益生菌時，不應該僅僅考慮菌株的功能，更要參考菌株的遺傳穩(wěn)定性和生存能力等，這些性能關系到益生菌在腸道中的生存和定殖以及在生產應用中其益生特性的發(fā)揮。鼠李糖乳桿菌Probio-M9是2017年從中國多地的健康母乳中分離出的一株益生菌，多項研究證實，鼠李糖乳桿菌Probio-M9具有耐酸、耐膽鹽特性，其顯著的益生特性體現(xiàn)在能夠活著進入人體腸道，對腸道菌群起到調節(jié)作用并增強機體免疫力，其在食品工業(yè)中廣泛應用，而目前所做研究更多的停留在生理生化水平，對菌株的遺傳穩(wěn)定性研究少之又少。
本研究中，對鼠李糖乳桿菌Probio-M9在MRS培養(yǎng)基（液體培養(yǎng)基）中連續(xù)培養(yǎng)5個代時（0，25，50，75，100代）過程中的表型特征及基因組穩(wěn)定性進行分析。采用全基因組及重測序方法對不同代時15株菌進行測序，基因組大小、GC含量表明15株連續(xù)培養(yǎng)的菌株與鼠李糖乳桿菌Probio-M9原始菌株基因組均無明顯差異，系統(tǒng)發(fā)育關系表明15株菌與原始基因組具有較近的親緣性。在識別到的SNP位點來看，每兩個傳代代時間均未發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定遺傳的突變位點，且菌株共線性良好。同時，從基因組水平編碼基因的突變水平證實了鼠李糖乳桿菌Probio-M9在連續(xù)培養(yǎng)100代過程中具有穩(wěn)定表型特征及代謝特性。
綜上所述，本試驗結果表明鼠李糖乳桿菌Probio-M9在連續(xù)傳代過程中具有良好的遺傳穩(wěn)定性，可為其后期開發(fā)應用提供理論參考。
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