銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.a)屬于非發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌，是醫(yī)院內(nèi)獲得性感染中最常見(jiàn)的一種條件致病菌，可引起肺炎、尿路感染以及菌血癥。當(dāng)人體免疫功能低下時(shí)，例如在嚴(yán)重?zé)齻颊?、癌癥病人、術(shù)后患者以及免疫缺陷病毒感染的患者中可引起嚴(yán)重感染。2021年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，從301917份臨床分離的標(biāo)本中檢出革蘭氏陰性菌占71.4％，其中銅綠假單胞菌以7.96％排名第四位。在西班牙的一項(xiàng)研究中，從357名急性白血病合并血流感染的患者體內(nèi)共分離出110種多重耐藥菌，其中以銅綠假單胞菌為主，整體死亡率達(dá)14.8％。在美國(guó)，10％～30％的銅綠假單胞菌分離株對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥，同時(shí)也是引起呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的主要病原體?？股氐膹V泛使用、過(guò)度使用和濫用與抗微生物藥物耐藥性的爆炸性增長(zhǎng)有關(guān)，銅綠假單胞菌也因多重耐藥和泛耐藥被世界衛(wèi)生組織(World health organization,WHO)于2017年列入對(duì)人類(lèi)健康構(gòu)成最大威脅的全球優(yōu)先病原體名單。因此，解決銅綠假單胞菌多重耐藥問(wèn)題已成為當(dāng)務(wù)之急。
因此，研究和開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物以解決日益嚴(yán)重的銅綠假單胞菌耐藥問(wèn)題已迫在眉睫，而抗菌肽是一個(gè)選擇。
抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是生物體內(nèi)一些具有抗菌活性的小分子多肽，在機(jī)體受感染或免疫刺激的誘導(dǎo)下產(chǎn)生，具有獨(dú)特的抗菌機(jī)制及抑菌活性，對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒、原蟲(chóng)以及腫瘤細(xì)胞等都具有一定的殺滅活性，部分具有免疫調(diào)節(jié)功能的抗菌肽甚至能夠促進(jìn)傷口愈合。有研究表明，昆蟲(chóng)抗菌多肽在抗藥性發(fā)展方面優(yōu)于單個(gè)肽和小分子抗生素，其獨(dú)特的抗菌機(jī)制可減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。隨著抗生素的濫用和超級(jí)耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生，昆蟲(chóng)抗菌肽已成為設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物的重要資源。
家蠅可作為抗菌肽研發(fā)的重要資源。已報(bào)道的與家蠅有關(guān)的抗菌肽包括攻擊素(attacin)、天蠶素(cecropin)、防御素(defensin)、溶菌酶(lysozyme)、雙翅肽(diptericin)等。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于家蠅抗菌肽的研究主要集中在分離、純化和抗菌功能方面，對(duì)于抗菌機(jī)制的研究主要是針對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、沙門(mén)菌和真菌，而關(guān)于家蠅抗菌肽對(duì)于銅綠假單胞菌的抗菌活性和作用機(jī)制尚未有報(bào)道。
在前期研究中，課題組對(duì)家蠅3齡幼蟲(chóng)的全蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出一條對(duì)家蠅免疫防御發(fā)揮積極作用且特異性高表達(dá)的基因，利用基因工程的方法成功合成出重組蛋白并命名為家蠅抗菌肽AMP-17(Musca domestica antimicrobialpepitides-17，AMP-17)，且對(duì)AMP-17基因進(jìn)行了克隆表達(dá)、抗菌活性及時(shí)空表達(dá)模式的研究。有研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽可以與菌體細(xì)胞外膜、細(xì)胞內(nèi)膜相互作用，從而破壞膜結(jié)構(gòu)引起細(xì)菌死亡，那抗菌肽AMP-17是否也可通過(guò)類(lèi)似機(jī)制發(fā)揮抗細(xì)菌活性？因此，將抗菌肽AMP-17作用于金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌及銅綠假單胞菌，結(jié)果顯示均有抑制作用，其中對(duì)銅綠假單胞菌抑制作用較為明顯，且對(duì)臨床分離的耐藥銅綠假單胞菌仍有較好的抗菌活性。
但現(xiàn)有技術(shù)中，抗菌肽AMP-17通過(guò)哪些途徑發(fā)揮抗菌作用、是否破壞細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，其抗菌作用機(jī)制尚未可知，因此需要對(duì)以上問(wèn)題提出一種新的解決方案。
家蠅抗菌肽AMP-17抑制銅綠假單胞菌的研究方法，至少包括以下步驟：
S1：進(jìn)行抗菌活性的檢測(cè)，抗菌活性的檢測(cè)至少包括抗菌肽AMP-17對(duì)銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測(cè)試、生長(zhǎng)曲線的檢測(cè)、單位時(shí)間下殺菌曲線記錄、抑制生物被膜形成實(shí)驗(yàn)、清除成熟生物被膜實(shí)驗(yàn)和綠膿菌素的測(cè)定；
S2：進(jìn)行AMP-17抗菌機(jī)制研究，AMP-17抗菌機(jī)制研究至少包括掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡、活死菌比例、外膜通透性、內(nèi)膜通透性、活性氧水平檢測(cè)；
S3：實(shí)驗(yàn)每組3個(gè)平行重復(fù)，所有數(shù)據(jù)經(jīng)Graph Pad Prism 8.0.1處理后用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，T檢驗(yàn)分析兩組間差異，定義P＜0.05為差異具有顯著性。
抗菌肽AMP-17對(duì)銅綠假單胞菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測(cè)試至少包括如下步驟：
將菌液在MHB肉湯培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種2次，確保細(xì)菌的純度及活力；
取1個(gè)單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用細(xì)菌比濁儀將菌懸液調(diào)至1×106CFU/mL備用；
將不同濃度的AMP-17與1.0×106CFU/mL菌懸液在96孔板中于37℃共同培養(yǎng)16～18小時(shí)；
從判定為MIC的孔及高于該孔藥物濃度的孔中取100μL菌液稀釋到合適濃度后在LB固體培養(yǎng)基上均勻涂布，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，以LB固體平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的抗菌肽濃度為MBC。
生長(zhǎng)曲線的檢測(cè)至少包括以下步驟：制備1.0×106CFU/mL菌懸液，將菌懸液加入96孔板中；
與不同濃度的AMP-17共同置于37℃孵育24小時(shí)，每小時(shí)測(cè)定一次630nm處的吸光度值，記錄結(jié)果并繪制生長(zhǎng)曲線；
以4μg/mL多粘菌素B作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌MHB作為空白對(duì)照，添加菌懸液的MHB培養(yǎng)基為陰性對(duì)照；
單位時(shí)間下殺菌曲線記錄至少包括以下步驟：以P.a CMCC 10104作為模型菌株，研究AMP-17隨時(shí)間變化對(duì)該菌作用的影響，將25μg/mL的AMP-17和50μg/mL的AMP-17與1×106CFU/mL的菌懸液在37℃下孵育24h；
當(dāng)孵育0、1、2、4、6、8、10、12、24h時(shí)，從中取10μL經(jīng)AMP-17作用的菌懸液以十倍稀釋度在MHB培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋至適當(dāng)濃度；
吸取5μL稀釋液在LB固體平板上點(diǎn)樣，待菌落長(zhǎng)出后計(jì)數(shù)菌落數(shù)并繪制單位時(shí)間下殺菌曲線。
表1多種抗菌藥物對(duì)銅綠假單胞菌的MIC值生長(zhǎng)曲線的檢測(cè)：
參閱圖1，未經(jīng)AMP-17處理的對(duì)照組中P.a CMCC 10104生長(zhǎng)曲線呈“S”型,在16小時(shí)后細(xì)菌生長(zhǎng)到達(dá)靜止期。經(jīng)25μg/mL(1×MIC)的AMP-17作用后，P.a CMCC 10104生長(zhǎng)在10h內(nèi)受到抑制，當(dāng)使用50μg/mL(2×MIC)的AMP-17處理后，培養(yǎng)至24h P.a CMCC 10104沒(méi)有增長(zhǎng)。
小結(jié)
通過(guò)觀察經(jīng)藥物作用后細(xì)菌胞外形態(tài)、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、活死菌比例、外膜滲透性、內(nèi)膜通透性等改變，從形態(tài)結(jié)構(gòu)和分子水平方向?qū)咕腁MP-17對(duì)銅綠假單胞菌抗菌機(jī)制進(jìn)行更便捷的研究，為設(shè)計(jì)具有良好抗菌活性的肽類(lèi)抗生素提供新思路，為新型抗菌藥物的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，為臨床治療提供新方向。
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