摘要 由于益生菌對消化系統(tǒng)的強酸和高濃度膽汁鹽環(huán)境較為敏感，并且在腸道中定殖能力較低，因此開發(fā)新穎有效的益生菌包埋體系用于解決上述問題很有必要。本研究使用羧甲基化β-葡聚糖（mGN），通過金屬-酚醛網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（Fe-TA）的橋聯(lián)作用，將其黏附在乳酸乳球菌（LL）表面，構(gòu)建乳酸乳球菌的包埋體系LL@Fe-TA@mGN，并評價LL@Fe-TA@mGN 對胃液與膽鹽的抗性及其在體內(nèi)的滯留能力。結(jié)果表明：當mGN 的質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL 時，LL@Fe-TA@mGN 體系的粒徑和zeta-電位都達到峰值，表明該質(zhì)量濃度為mGN 包埋單個乳酸乳球菌的最佳質(zhì)量濃度。在MRS 液體培養(yǎng)基中，LL@Fe-TA@mGN 的生長曲線與LL 的生長曲線沒有顯著性差異，說明mGN 的毒性可以忽略不計。在掃描電鏡與透射電鏡分析中均可清晰地看到一層“膜”完整地包覆在乳酸乳球菌表面。經(jīng)2 h 模擬胃液與膽鹽的孵育，mGN 包埋后的LL 抗胃液能力與抗膽鹽能力相比于未包埋的LL 分別提升14.63 倍與1.94 倍。體內(nèi)熒光成像實驗證實LL@Fe-TA@mGN 具有更強的腸道滯留能力。綜上，本研究開發(fā)的乳酸乳球菌單菌包埋技術(shù)能夠顯著提升乳酸乳球菌的胃腸道抗性與體內(nèi)滯留能力。研究結(jié)果可為益生菌包埋系統(tǒng)的開發(fā)與利用提供新的思路和策略。
1980 年，俄羅斯諾貝爾獎獲得者 Elie Metchnikoff 首次提出益生菌的概念，闡述了乳酸菌對人體的潛在益處，并提出乳酸菌長壽論。在隨后的幾十年時間里，人們對益生菌的研究越來越深入。研究表明，益生菌對宿主健康狀況存在積極的影響。保持益生菌在胃腸道的高存活率，是益生菌在宿主體內(nèi)發(fā)揮有效功能的必要條件。然而，在口服過程中，由于益生菌對胃腸道強酸和高濃度膽汁鹽的環(huán)境較為敏感，經(jīng)胃腸道消化后很難存活與定殖，使最終定殖在腸道中的益生菌的數(shù)量低于世界糧農(nóng)組織（FAO）所建議的最低理論值。此外，由于益生菌對腸壁的附著力差，定殖效率低，進一步影響了益生菌的功效。鑒于此，研究開發(fā)保護益生菌的方法，對于提高益生菌在胃腸道的存活率及在腸道的定殖率具有重大的現(xiàn)實意義。
目前，有多種方法可以幫助益生菌在口服過程中存活和繁衍，并提高益生菌的腸道定殖效率，如擠出、冷凍干燥、噴霧干燥和微膠囊化等。這些方法雖然在一定程度上提升了益生菌在腸道中的活性，但是存在操作復(fù)雜、產(chǎn)率低等問題，同時可能對益生菌造成機械損傷。因此，迫切需要找到一種簡單有效的方法來包埋益生菌，以增強益生菌對胃腸道環(huán)境應(yīng)激的抵抗能力，延長益生菌在腸道的滯留時間，提高益生菌定殖率，達到更好地發(fā)揮益生菌在體內(nèi)效能的目的。
選擇合適的壁材與包埋方法對益生菌的有效包埋至關(guān)重要。β-葡聚糖（GN）是一種常見的益生元，廣泛存在于大麥、小麥和燕麥等天然植物中，可被腸道菌群代謝為短鏈脂肪酸，表現(xiàn)出豐富的生理活性，如改善腸道環(huán)境，增加腸道菌群豐度和修復(fù)腸道屏障等。除了優(yōu)越的生物活性，GN的大孔蜂窩狀結(jié)構(gòu)，可以比任何其它壁材更有效地捕獲微生物。由于GN 在上消化道穩(wěn)定，可以減輕益生菌在進入腸道過程中失活的風險，提高益生菌的存活率，并將益生菌高濃度地輸送到指定部位，因此現(xiàn)已作為益生菌包埋壁材使用。朱瑩瑩等利用青稞β-葡聚糖對植物乳桿菌進行包埋，顯著地提升了植物乳桿菌的胃腸道耐受性。然而，GN 存在黏度大、溶解性差等問題。羧甲基化β-葡聚糖（mGN）在不改變GN 空間結(jié)構(gòu)的同時，在很大程度上解決了其難溶于水的問題，并提升了GN 的生物活性。然而，mGN 無法直接黏附在單個益生菌的表面對其進行保護。尋找到能夠連接內(nèi)層益生菌與壁材mGN 的 “橋梁”，是實現(xiàn)mGN 對單個益生菌包埋的關(guān)鍵。金屬-酚醛網(wǎng)絡(luò)是由酚類配體（如單寧酸）和金屬離子（如Fe3+）組成的超分子復(fù)合物，可通過一步法簡便地組裝成配位絡(luò)合物，并黏附在多種材料表面。酚類物質(zhì)具有較多羥基和較高的黏附能力，可通過氫鍵作用將mGN 吸附到金屬-酚醛網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的表面，達到mGN 對益生菌包埋的目的。
乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，LL）是乳酸菌屬中的一種重要模式菌，同樣也是食品級微生物（Generally regards as safe，GRAS），被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。LL 具有促進消化，維持腸胃菌群平衡，提高宿主免疫力和加固腸道黏膜等作用。然而，關(guān)于乳酸乳球菌包埋的研究較少，而包埋單個乳酸乳球菌的研究更鮮見報道。基于此，本研究以mGN 作為壁材，通過金屬-酚醛網(wǎng)絡(luò)的橋聯(lián)作用，將mGN 黏附在LL 表面，旨在探究其對所包埋的LL 胃腸道耐受性及腸道滯留能力的影響。
1 材料與方法
1.1 原料、菌種、試劑與實驗動物
乳酸乳球菌由南昌大學陳廷濤教授團隊提供。MRS 液體培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；單寧酸（Tannic acid，TA），美國Sigma-Aldrich；六水合三氯化鐵（FeCl3·6H2O），西隴科學股份有限公司；Sulfo-Cyanine5-DBCO（Cy5），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Phosphate buffer saline（PBS）緩沖片，武漢賽維爾生物科技有限公司；β-葡聚糖，愛爾蘭Megazyme 有限公司。本研究中使用的所有其它試劑均為分析純級。
10 只SPF 級C56BL/6J 雄鼠，體質(zhì)量（20±2）g，周齡6～8 周，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司（許可證號：SCXK（京）2019-0010）。飼養(yǎng)條件：房間溫度為（22±1）℃，12 h/12 h 的燈光/黑夜循環(huán)。小鼠在自由飲食、飲水飼養(yǎng)適應(yīng)環(huán)境1 周后，將小鼠隨機分為2 組，每組5 只，分別為LL 灌胃組與LL@Fe-TA@mGN 灌胃組。
1.2 設(shè)備與儀器
BSC-1304ⅡA2 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HPX-11-80 生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；TD5A-WS 臺式低速離心機，湖南湘怡實驗室儀器開發(fā)有限公司；ZWYR-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；馬爾文3000 激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；JSM-6701F 冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Cold field emission scanning electron microscope，SEM），日本電子株式會社；透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope，TEM），日本日立公司；活體成像系統(tǒng)，深圳凱佳光學科技有限公司。
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