2.4 低濃度微酸性電解水處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)容物的影響
2.4.1 DNA和蛋白質(zhì)的泄漏
細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏的測(cè)定是細(xì)胞膜完整性損傷的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)。如圖3所示，與對(duì)照組相比，副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌經(jīng)低濃度微酸性電解水處理后細(xì)胞外DNA水平顯著升高，且呈濃度依賴關(guān)系。而細(xì)胞外蛋白水平雖然呈增加趨勢(shì)，但只有副溶血性弧菌在有效氯濃度為10毫克/升時(shí)顯著高于對(duì)照組。當(dāng)?shù)蜐舛任⑺嵝噪娊馑饔糜诩?xì)菌時(shí)，釋放到細(xì)胞外的蛋白質(zhì)和DNA大分子，可作為膜損傷的主要特征物質(zhì)。蛋白質(zhì)與DNA泄露的變化趨勢(shì)一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了低濃度微酸性電解水對(duì)細(xì)胞膜完整性的破壞。
A-蛋白質(zhì)；B-DNA
圖3 低濃度微酸性電解水處理對(duì)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA滲漏的影響
2.4.2 細(xì)胞內(nèi)K+的滲漏
K+是細(xì)菌內(nèi)最豐富的陽(yáng)離子，參與基本的生命活動(dòng)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓和氧化還原電位。鉀通道的激活和鉀離子的泄漏與超極化現(xiàn)象密切相關(guān)，K+的泄漏已被用來(lái)監(jiān)測(cè)抗菌劑造成的細(xì)菌膜破壞。如圖4所示，除了腐敗希瓦氏菌在有效氯濃度為1、2毫克/升時(shí)，經(jīng)低濃度微酸性電解水處理后2種細(xì)菌的上清液中K+濃度都具有顯著性差異，與膜電位檢測(cè)結(jié)果完全吻合。細(xì)胞內(nèi)K+的損失會(huì)造成多種代謝途徑受阻，破壞細(xì)胞滲透壓的調(diào)節(jié)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。
圖4 低濃度微酸性電解水處理對(duì)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌胞內(nèi)K+滲漏的影響
2.5 低濃度微酸性電解水處理對(duì)細(xì)菌膜電位和電導(dǎo)率的影響
膜電位指質(zhì)子通量引起的電化學(xué)梯度在細(xì)胞膜上產(chǎn)生的電位差，是合成ATP的驅(qū)動(dòng)力之一。本研究用探針DiBAC4檢測(cè)低濃度微酸性電解水對(duì)副溶血性弧菌與腐敗希瓦氏菌的膜電位的影響。如圖5-A所示，有效氯濃度為6、10毫克/升的低濃度微酸性電解水處理后2種細(xì)菌的膜電位都存在顯著性差異。低濃度微酸性電解水使2種細(xì)菌的膜電位降低，導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化，且呈有效氯濃度依賴性。劉等報(bào)道了微酸性電解水可引起腐敗希瓦氏菌和腐生葡萄球菌的超極化現(xiàn)象，與本研究結(jié)論一致。膜電位發(fā)生超極化可能是由于低濃度微酸性電解水處理導(dǎo)致了細(xì)胞膜上離子通道的失活和破壞，部分帶電離子跨膜運(yùn)輸，使膜內(nèi)外電位差增大，極化狀態(tài)加強(qiáng)。
A-膜電位；B-電導(dǎo)率
圖5 低濃度微酸性電解水處理對(duì)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的膜電位和電導(dǎo)率的影響
細(xì)菌電導(dǎo)率的變化可以反映其細(xì)胞膜通透性的改變，其改變常伴隨著胞內(nèi)小分子物質(zhì)如離子、磷酸鹽等電解質(zhì)的流出。如圖5-B所示，經(jīng)低濃度微酸性電解水處理后，隨著濃度的增加，副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的電導(dǎo)率相應(yīng)升高，且與對(duì)照組對(duì)比都具有顯著性差異。根據(jù)膜電位、電導(dǎo)率和胞外K+含量等通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，都說(shuō)明細(xì)菌膜內(nèi)外出現(xiàn)離子紊亂，標(biāo)志著細(xì)胞膜通透性的增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常。
2.6 低濃度微酸性電解水處理后細(xì)胞內(nèi)活性氧和ATP水平的變化
活性氧是細(xì)胞代謝的副產(chǎn)物，過(guò)量累積會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)生物大分子的氧化損傷，從而破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)和功能。如圖6-A所示，隨著有效氯濃度的增加，2種細(xì)菌胞內(nèi)活性氧的含量都逐漸增加。尤其是當(dāng)有效氯濃度為6和10毫克/升時(shí)，活性氧水平顯著高于對(duì)照組。有研究報(bào)道，微酸性電解水有效地抑制了單增李斯特菌和假單胞菌的抗氧化酶系統(tǒng)的活性。因此，本研究中低濃度微酸性電解水可能破壞了菌體的抗氧化防御系統(tǒng)，導(dǎo)致了活性氧的大量產(chǎn)生和積累，從而誘導(dǎo)細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸的過(guò)氧化以及蛋白質(zhì)羰基化。而上述2.4.1節(jié)中，細(xì)胞外蛋白水平?jīng)]有明顯變化，可能是蛋白質(zhì)很快會(huì)與細(xì)菌內(nèi)活性氧或低濃度微酸性電解水中氯物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。
A-活性氧；B-ATP
圖6 低濃度微酸性電解水處理對(duì)副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌胞內(nèi)活性氧和ATP的影響
ATP是微生物可利用能量的基本載體。ATP含量的降低會(huì)影響菌體的生命活動(dòng)，抑制其生長(zhǎng)和分裂。本研究中ATP的測(cè)定采用生物發(fā)光法。如圖6-B所示，與對(duì)照組相比，低濃度微酸性電解水可顯著降低細(xì)胞內(nèi)ATP濃度，且具有有效氯濃度依賴性。細(xì)菌內(nèi)ATP的迅速耗盡，可能是因?yàn)榈蜐舛任⑺嵝噪娊馑艏?xì)胞膜導(dǎo)致ATP的泄漏；膜電位的消耗引起ATP的合成受阻；以及細(xì)胞內(nèi)ATP酶的持續(xù)水解。
2.7 低濃度微酸性電解水處理對(duì)細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的影響
2.7.1 細(xì)胞形態(tài)變化
為了證實(shí)低濃度微酸性電解水引起的細(xì)菌損傷，采用掃描電子顯微鏡觀察處理后的菌體形態(tài)。對(duì)照組的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌，均表現(xiàn)出典型的革蘭氏陰性桿菌的結(jié)構(gòu)，表面規(guī)則光滑。經(jīng)低濃度微酸性電解水處理的副溶血性弧菌表面出現(xiàn)明顯的凹陷及褶皺，且隨著低濃度微酸性電解水濃度的升高，菌體嚴(yán)重皺縮甚至形成不規(guī)則小孔，導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏。而腐敗希瓦氏菌經(jīng)低濃度微酸性電解水處理后表面結(jié)構(gòu)無(wú)明顯坍塌，僅在質(zhì)量濃度≥2毫克/升時(shí)出現(xiàn)凹陷和皺縮。結(jié)果表明，低濃度微酸性電解水對(duì)2種細(xì)菌都具有一定的損傷作用，破壞程度呈濃度依賴性。并且在相同濃度下，副溶血性弧菌較腐敗希瓦氏菌表現(xiàn)出更顯著的結(jié)構(gòu)變化。
A-副溶血性弧菌；B-腐敗希瓦氏菌
圖7 低濃度微酸性電解水處理后副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的SEM圖像
注：a-對(duì)照組；b-有效氯濃度=1毫克/升；c-有效氯濃度=2毫克/升；d-有效氯濃度=6毫克/升；e-有效氯濃度=10毫克/升。
2.7.2 細(xì)胞質(zhì)膜完整性
使用混合熒光染料Syto 9和PI進(jìn)行菌體染色，檢測(cè)經(jīng)低濃度微酸性電解水處理后細(xì)胞質(zhì)膜的通透性變化。低分子質(zhì)量綠色熒光染料Syto 9可以穿透完整和受損的細(xì)胞質(zhì)膜，而高分子質(zhì)量紅色熒光染料PI只能穿透受損的細(xì)胞質(zhì)膜。對(duì)照組的副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌均顯示Syto 9染料的綠色熒光，說(shuō)明細(xì)胞膜是完整的。而經(jīng)低濃度微酸性電解水處理的細(xì)菌出現(xiàn)黃色或紅色熒光，且隨著低濃度微酸性電解水濃度的升高，2種熒光比例增加，表明質(zhì)膜完整性受損。并且在相同濃度下，副溶血性弧菌的黃色或紅色熒光比例明顯高于腐敗希瓦氏菌，表明低濃度微酸性電解水對(duì)副溶血性弧菌細(xì)胞質(zhì)膜完整性的破壞更強(qiáng)。
A-副溶血性弧菌；B-腐敗希瓦氏菌
圖8 低濃度微酸性電解水處理后副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌的CLSM圖像
3 結(jié)論
本研究以海蝦中優(yōu)勢(shì)致病菌-副溶血性弧菌和優(yōu)勢(shì)腐敗菌-腐敗希瓦氏菌為研究對(duì)象，探究了低濃度微酸性電解水對(duì)純培養(yǎng)及海蝦表面接種菌的殺菌效果以及作用機(jī)制。結(jié)果表明，低濃度微酸性電解水對(duì)2種菌均具有較強(qiáng)的殺滅作用，殺菌效果呈有效氯濃度依賴性；并且隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，低濃度微酸性電解水對(duì)蝦表面接種菌的殺滅效果也增強(qiáng)。低濃度微酸性電解水殺滅副溶血性弧菌和腐敗希瓦氏菌可能的機(jī)制包括：低濃度微酸性電解水破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致膜通透性增加，造成DNA、蛋白質(zhì)、ATP、K+等內(nèi)容物的泄漏，激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果證實(shí)了低濃度微酸性電解水對(duì)細(xì)胞外部結(jié)構(gòu)的破壞作用；低濃度微酸性電解水造成細(xì)胞膜超極化現(xiàn)象，細(xì)菌膜電位的改變干擾細(xì)胞正常的代謝活動(dòng)，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。部分離子通道激活導(dǎo)致K+等電解質(zhì)的泄露正是造成細(xì)胞膜超極化的原因之一，而電導(dǎo)率的增加證明了膜內(nèi)外的離子紊亂；低濃度微酸性電解水造成ATP的快速耗盡，抑制細(xì)胞的生命活動(dòng)；低濃度微酸性電解水導(dǎo)致了活性氧的大量產(chǎn)生和積累，造成細(xì)胞中生物大分子的氧化損傷，以及細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸和膜蛋白的過(guò)氧化，從而破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。
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