結(jié)果
分離耐金屬硝酸鹽還原ORR菌株。
為了確定ORR污染點是否存在微生物，能夠通過硝酸鹽還原在髙濃度金屬存在下獲取生長能量，配制了一種多金屬混合物（COMM），包含八種金屬（Al、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Cd和U），模擬ORR點S-3池塘附近高度污染井中地下水的金屬。COMM的組成如表1所示。這代表了先前對ORR污染點80個不同地下水井分析中測量的金屬濃度。例外是Mn和Al的濃度，在COMM中顯著低于最嚴重污染井，以最小化使用的生長培養(yǎng)基中的沉淀問題。為了分離新菌株，設(shè)置了一系列超過2000個高通量富集，使用ORR未污染和污染區(qū)域的地下水和水沉積物作為接種物。未污染水定義為含鈾量低于126 nM（EPA飲用水允許限值），這存在于ORR S-3池塘污染羽流外的井中。COMM添加到約90%的富集中，其余包含either 10倍較低濃度（0.1x COMM）或升高U濃度（100至400μM；COMM含100μM U）而無其他金屬。硝酸鹽使用濃度為20 mM或50 mM，也基于污染井中的濃度（表1）。富集中變化的其他參數(shù)包括碳源（乙醇、乳酸、富馬酸鹽、丙酮酸鹽、葡萄糖、纖維素或堆肥茶）、pH（3.0至7.0）、氧合（好氧、微好氧[3%O2]或厭氧）以及存在硫酸鹽（20 mM）而非硝酸鹽或無末端電子受體添加。富集在22°C培養(yǎng)，生長在3個月內(nèi)監(jiān)測。從顯示生長的富集通過平板分離獲得分離物。
通過16S rRNA基因測序，獲得21種新菌株，除六種序列外，所有序列均被多個獨立分離物觀察到。附有它們最接近的16S rRNA基因序列物種。它們代表多種細菌，包括一種放線菌、八種厚壁菌門芽孢桿菌綱菌株，以及十種變形菌門來自α-、β-和γ-變形菌綱。最常見的分離物是各種Rhodanobacter菌株，其中一種被分離17次，以及各種Bacillus菌株，有四種不同菌株，每種被分離3至7次。
這21種ORR菌株中的七種被選擇進行深入研究，基于它們厭氧生長通過硝酸鹽還原的能力（表2）。這些被命名為MT049、MT058、MT066、MT086、MT094、MT123和MT124。它們的富集條件及其最接近的16S rRNA基因序列分析親屬示于表2。七種菌株中，五種從ORR S-3池塘附近高度污染地下水接種的富集中分離，一種（MT049）來自未污染ORR地下水樣品，另一種（MT058）來自未污染ORR土壤樣品。它們包括兩種Bacillus（MT066和MT094）和兩種Paenibacillus（MT086和MT124）革蘭氏陽性菌株，以及各一種Pantoea（MT058）、Castellaniella（MT123）和Serratia（MT049）革蘭氏陰性菌株。七種菌株中的六種在存在至少20 mM硝酸鹽下分離，而四種在存在COMM下分離，兩種在存在0.1x COMM下分離，一種在存在200μM U無其他金屬下分離（表2）。菌株分離使用的碳源包括甲酸鹽、乙醇、葡萄糖、乳酸-富馬酸鹽混合物和堆肥茶。后者從商業(yè)堆肥設(shè)施獲取的堆肥制備，用于富集兩種Bacillus菌株和一種Paenibacillus菌株。
ORR菌株的碳源和pH依賴性。
七種ORR菌株在厭氧條件下生長于20 mM硝酸鹽和指定碳源下的pH曲線示于圖1。在大多數(shù)情況下，菌株分離來源的ORR地下水樣品的pH值低于分離所用富集培養(yǎng)基的pH（表2）或分離物觀察到的pH最適值（圖1和表2）。例如，兩種Paenibacillus物種（MT086和MT124）從具有最低pH（3.0）和大多數(shù)污染金屬最高濃度的地下水（井FW126）分離（表1）。然而，MT086在pH 5.5富集，生長最適pH從6.0到8.0（圖1），而MT124在pH 7.0富集，生長pH范圍從5.5到8.0，最適pH 7.5（圖1和表2）。沒有分離物在pH 3.0生長；然而，所有三種革蘭氏陰性分離物（MT049、MT058和MT123）以及一種Bacillus革蘭氏陽性分離物（MT094）在pH 4.0有可測量生長（圖1），每種情況都低于它們分離來源地下水的pH（表2）。Castellaniella物種菌株MT123是最耐酸的，最適pH 5.5，低于富集pH（6.5）。所有其他菌株的pH最適值顯著高于分離所用培養(yǎng)基。例如，Bacillus sp.菌株MT066有圍繞7.0的寬pH最適值，并在pH 5.5富集。
每種七種ORR菌株的pH最適值用于碳源和金屬耐受性實驗，生長使用六種不同碳源（甲酸鹽、乙醇、富馬酸鹽、乳酸、丙酮酸鹽和葡萄糖）在厭氧、硝酸鹽還原條件下與20 mM硝酸鹽測量。這在S-3池塘附近污染井的硝酸鹽濃度范圍內(nèi)，變化范圍9.2至188 mM（表1）。結(jié)果示于圖2。三種菌株（MT066、MT086和MT123）無法在任何碳源上生長，除非硝酸鹽存在，而其他四種菌株在至少一種碳源上存在硝酸鹽時表現(xiàn)出生長增加。在無硝酸鹽下能生長的菌株中，生長僅觀察到丙酮酸鹽和葡萄糖上。例如，Paenibacillus sp.菌株MT124僅在葡萄糖上生長，Pantoea sp.菌株MT058僅在丙酮酸鹽和葡萄糖上無硝酸鹽時生長。大多數(shù)菌株，包括兩種Bacillus菌株（MT066和MT094）以及Castellaniella菌株（MT123），在硝酸鹽存在下在所有或大多數(shù)測試碳源上顯示顯著生長。支持最高生長速率或硝酸鹽存在下生長速率增加最多的碳源用于設(shè)計測定它們對金屬響應(yīng)和測量硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶活性的生長培養(yǎng)基。
ORR菌株的金屬耐受性。
ORR S-3池塘附近污染地下水的定義特征之一是多種金屬的升高濃度，這些金屬以三種不同離子形式存在，取決于金屬和氧化態(tài)。地下水含有升高濃度的陽離子Al3+、Fe2,3+、Cd2+、Cu2+、Co2+、Ni2+和Mn2+，氧陰離子CrO42-，以及氧陽離子UO2+。對所有七種ORR菌株獲得了劑量響應(yīng)曲線，使用所有這些金屬，單獨或與COMM。Al和Fe未包括在本研究中，由于沉淀問題（Al3+和Fe3+在我們的生長培養(yǎng)基中在pH>5.5和>3.0時沉淀）。還測定了所有七種菌株對硝酸鹽和亞硝酸鹽的敏感性。劑量響應(yīng)曲線用于計算每種離子或COMM的半最大效應(yīng)濃度（EC50）值，這些示于表3。
正如預(yù)期，所有七種菌株能夠在高濃度硝酸鹽存在下生長，EC50值范圍從167 mM到顯著的711 mM。這些濃度下的生長超過了ORR環(huán)境中觀察到的濃度，其中最污染井（FW126）含188 mM硝酸鹽（表1）。亞硝酸鹽的EC50值低于硝酸鹽，范圍從9.0到77 mM。四種革蘭氏陽性菌株中的三種（MT066、MT094和MT124）比亞硝酸鹽的EC50值顯著高于革蘭氏陰性菌株（MT049、MT058和MT123）。然而，硝酸鹽和亞硝酸鹽耐受性之間似乎沒有相關(guān)性。
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