1.3.5蛋白水解活力的測定
蛋白水解活力測定。取2 mL 1.5%酪蛋白溶液于35℃保溫5 min，加入0.5 mL預熱好的待測酶液混勻后繼續(xù)水浴恒溫放置60 min，然后加入2 mL 8%的三氯乙酸終止反應，將沉淀過濾后測定濾液在280 nm波長處的吸光度，記為A1。制備空白樣品時，先取0.5 mL待測酶液直接與8%的三氯乙酸混合，使其立刻終止反應，后加入2 mL 1.5%酪蛋白溶液，重復過濾步驟，濾液作為空白對照，測定其在280 nm波長處的吸光度，記為A2。
本實驗條件下，60 min引起A280nm增加0.001所需的酶量為1個酶活力單位，按公式（2）計算：
1.3.6產(chǎn)凝乳酶菌株的鑒定
1.3.6.1形態(tài)學觀察
將產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢菌在LB固體平板上劃線，于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落生長情況及菌落形態(tài)。將菌體進行芽孢染色及革蘭氏染色后于高倍顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。
1.3.6.2 API試劑條法對菌株鑒定
將平板中培養(yǎng)好的新鮮菌體用無菌生理鹽水溶解，根據(jù)API 50 CHB比濁法達到菌體濃度要求，然后分別加入API 50 CHB試劑盒各孔內(nèi)，37℃靜置培養(yǎng)24 h和48 h，觀察試劑盒各孔顏色的變化。
1.3.6.3菌株16S rDNA序列擴增與分析
采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA，根據(jù)上述菌株鑒定所得由桿菌科的16S rDNA序列設計引物：正向引物P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物P2：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。以菌株基因組DNA作為PCR擴增的模板，PCR體系（20μL）為：上下游引物各1μL、DNA模板1μL、超純水7μL、TaqDNA聚合酶10μL。PCR參數(shù)為：95℃預變性3 min；95℃變性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；70℃末端延伸10 min，4℃保存。取5μL產(chǎn)物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，將大小正確的目的片段送至北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序。將測序結(jié)果提交到GenBank中選取相關菌株的16S rDNA基因序列進行比對分析，選取相似性較高的序列，與實驗菌株一起用軟件MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。
1.3.7產(chǎn)凝乳酶菌株生長曲線和產(chǎn)酶活力曲線的的測定
1.3.7.1生長曲線的測定
從產(chǎn)凝乳酶菌株的平板中挑取少量菌體接種于已滅菌的液體LB培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)30 h，從2 h起每隔2 h測定菌體OD600nm值，實驗重復3次，繪制菌株生長曲線。
1.3.7.2酶活力曲線的測定
挑取少量LB-51菌體接入液體LB培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min條件下恒溫振蕩12 h，作為活化種子液；以3%的接種量接種于已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，裝液量為體積分數(shù)40%，30℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、12、24、36、48、60、72、84、96 h時，分別按照1.3.4和1.3.5節(jié)方法測定凝乳活力和蛋白水解活力，實驗重復3次，繪制菌株產(chǎn)酶活力曲線圖。
1.3.8菌株發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶及其分離提取
將活化的菌液以3%的接種量接種到已滅菌的LB液體培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心30 min以去除菌體，上清液放置于4℃冰箱內(nèi)冷卻2 h。向4℃的發(fā)酵液中加入預冷的無水乙醇，使混合后的乙醇體積分數(shù)為70%，迅速攪拌均勻，于4℃冰箱中靜置過夜，4℃、10 000 r/min離心30 min，沉淀用0.005 mol/L的pH 5.8的磷酸鹽緩沖液溶解以防止蛋白質(zhì)凝聚或變性，溶解液放置在4℃冰箱中冷藏，之后于4℃條件下透析除鹽并冷凍干燥成酶粉。
1.3.9凍干凝乳酶的凝乳活性評價
取0.01 g粗酶凍干粉于5 mL去離子水中，充分溶解后按照1.3.4節(jié)方法測定凝乳活力，根據(jù)公式（1）換算粗酶的單位酶活力，并與商業(yè)凝乳酶做對比。
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