隨著近些年來(lái)人們對(duì)釀酒酵母研究的深入，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以釀酒酵母作為底盤(pán)細(xì)胞用于合成生物學(xué)或工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，存在眾多局限性，于是越來(lái)越多研究者將目光轉(zhuǎn)入非常規(guī)釀酒酵母上，魯氏酵母便是其中一種。魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)屬于半子囊菌酵母，是一種耐鹽產(chǎn)醇的非釀酒酵母，菌落呈白色粘稠狀，在光學(xué)顯微鏡下觀察呈梭狀。由于魯氏酵母可以耐受更高的滲透壓，因此在高滲透壓的食品工業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用。相對(duì)于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，工業(yè)生產(chǎn)對(duì)于菌株生長(zhǎng)的抗逆性要求更高，在面對(duì)某些特殊環(huán)境壓力時(shí)，魯氏酵母表現(xiàn)出更優(yōu)良的穩(wěn)定性。
為了高效地實(shí)現(xiàn)對(duì)魯氏酵母的基因編輯，解決含有釀酒酵母的著絲粒序列的質(zhì)粒在魯氏酵母內(nèi)遺傳穩(wěn)定性差的問(wèn)題，提出一種可以在魯氏酵母內(nèi)穩(wěn)定且高效表達(dá)的質(zhì)粒系統(tǒng)，并將其用于后續(xù)魯氏酵母內(nèi)建立基因編輯系統(tǒng)。具體是通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)魯氏酵母源的ARS和CEN元件，將它們構(gòu)成著絲粒型游離質(zhì)粒；然后通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化法，將上述構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到魯氏酵母MQ1中；最后與轉(zhuǎn)入含釀酒酵母的著絲粒序列的質(zhì)粒的魯氏酵母重組菌株比較，通過(guò)測(cè)定相應(yīng)重組菌株的生長(zhǎng)曲線以及質(zhì)粒丟失率來(lái)表明具有魯氏酵母源ARS和CEN元件的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入魯氏酵母中表現(xiàn)出更高的遺傳穩(wěn)定性，獲得了具有更好的復(fù)制起始效率和遺傳穩(wěn)定性的ARS-G3，具有更好的遺傳穩(wěn)定性的CENE，穩(wěn)定性良好的質(zhì)粒pUC19-Nrs-ARS-B2-CENE，其對(duì)于后續(xù)在魯氏酵母內(nèi)建立一套穩(wěn)定的基因編輯系統(tǒng)具有重要意義。
首先用由生物信息學(xué)方法分析預(yù)測(cè)得到的魯氏酵母源ARS和CEN元件構(gòu)建不同的著絲粒型游離質(zhì)粒；其次通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化法將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入魯氏酵母MQ1中；最后測(cè)定相應(yīng)重組菌株的生長(zhǎng)曲線和質(zhì)粒丟失率，結(jié)果表明具有魯氏酵母源ARS和CEN元件的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入魯氏酵母中表現(xiàn)出更高的遺傳穩(wěn)定性。其中ARS-G3具有更好的復(fù)制起始效率和遺傳穩(wěn)定性，CENE具有更好的遺傳穩(wěn)定性，質(zhì)粒pUC19-Nrs-ARS-B2-CENE穩(wěn)定性良好。
為了考察不同ARS序列和CEN序列對(duì)游離型質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性的影響，以重組菌株MQ1-41Nrs(釀酒酵母源ARS)作為對(duì)照，對(duì)重組菌株MQ1-B2-A、MQ1-A1-A、MQ1-C4-A、MQ1-C7-A、MQ1-G1-A、MQ1-G2-A、MQ1-G3-A以及重組菌株MQ1-B2-A、MQ1-B2-B、MQ1-B2-C、MQ1-B2-D、MQ1-B2-E、MQ1-B2-G、MQ1-G3-E的生長(zhǎng)曲線和質(zhì)粒丟失率進(jìn)行了測(cè)定。
生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
將魯氏酵母重組菌株接種于添加適量抗生素的5mL YPD液體培養(yǎng)基內(nèi)，并置于30℃，250rpm條件下培養(yǎng)24h，次日將初始OD600值調(diào)整為0.2轉(zhuǎn)接一次，在相同條件下培養(yǎng)8h左右至對(duì)數(shù)期。使用無(wú)菌水洗滌兩遍菌體后，利用添加適量抗生素的YPD液體培養(yǎng)基，調(diào)整菌株初始OD600值為0.2，吸取300μL菌液轉(zhuǎn)移至全透明的100孔深孔板中，采用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線測(cè)定儀測(cè)定菌株的菌濃，培養(yǎng)溫度設(shè)定為30℃，每隔1h機(jī)器自動(dòng)記錄一次數(shù)據(jù)，直至OD600值趨于穩(wěn)定不變時(shí)結(jié)束測(cè)定，以此數(shù)據(jù)繪制生長(zhǎng)曲線。
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