3討論與結(jié)論
COR是P.syringae pv.tomato分泌的一種化合物，其分子結(jié)構(gòu)同茉莉酸衍生物茉莉酸異亮氨酸極其相似。茉莉酸異亮氨酸是植物激素茉莉酸的生物活性物質(zhì)，茉莉酸以茉莉酸異亮氨酸的活性形式同受體蛋白COI結(jié)合從而激活茉莉酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。COR是病原菌分泌的毒性因子，作為茉莉酸異亮氨酸的結(jié)構(gòu)類似物，在番茄中與受體蛋白COI1的親和力高于茉莉酸異亮氨酸，在植物激素途徑中發(fā)揮著與茉莉酸相似的調(diào)節(jié)作用。Uppalapati等對(duì)冠菌素、冠烷酸、冠菌酸和茉莉酸甲酯的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)COR相較于冠菌酸和冠烷酸具有更強(qiáng)的生物活性，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)基因中有大約40%的基因也能被COR誘導(dǎo)表達(dá)。
本試驗(yàn)利用RT-qPCR技術(shù)測(cè)得不同濃度COR處理?xiàng)l件下茉莉酸、水楊酸、乙烯相關(guān)基因以及PAL5的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)于茉莉酸相關(guān)基因來說，不同的COR注射濃度會(huì)呈現(xiàn)出不同的調(diào)節(jié)作用，高濃度的COR處理上調(diào)表達(dá)了MYC2基因和LoxD基因，低濃度和較低濃度的COR處理會(huì)導(dǎo)致番茄葉片MYC2基因和LoxD基因的下調(diào)表達(dá)。在健康的植物中存在著低水平的茉莉酸，這些茉莉酸能夠誘導(dǎo)JAZ阻遏蛋白的表達(dá)，而JAZ蛋白能夠抑制下游的茉莉酸信號(hào)通路。因此，低濃度COR可能誘導(dǎo)了茉莉酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而下調(diào)表達(dá)了MYC2基因和LoxD基因。PAL是一種重要的植物防御酶，在本試驗(yàn)中，PAL5基因的表達(dá)量在各濃度COR處理的誘導(dǎo)下顯著提高，表明COR具有誘導(dǎo)PAL表達(dá)的生理功能。外源茉莉酸甲酯施用到植株上能夠誘導(dǎo)LjPAL1基因的表達(dá)。PAL活性同內(nèi)源茉莉酸水平呈顯著正相關(guān)，高活性PAL的植株對(duì)死體營養(yǎng)菌尖刀鐮孢菌的抗性增強(qiáng)。因此，高濃度COR對(duì)PAL5基因的誘導(dǎo)作用可能來源于COR誘導(dǎo)的茉莉酸信號(hào)通路。但在低濃度和較低濃度時(shí)，COR在抑制了茉莉酸相關(guān)基因的表達(dá)的同時(shí)誘導(dǎo)PAL5基因的大量表達(dá)，說明COR對(duì)PAL5基因的誘導(dǎo)作用存在不依賴于茉莉酸途徑的其他作用途徑。本試驗(yàn)中，各濃度COR處理均導(dǎo)致了番茄葉片中PR1a基因的下調(diào)表達(dá)，而誘導(dǎo)了EIN2基因和EIN3基因的表達(dá)，表明COR具有抑制番茄體內(nèi)水楊酸信號(hào)途徑和激活乙烯信號(hào)途徑的功能。
植物在逆境條件下激活激素介導(dǎo)的防御反應(yīng)是極其耗能的，為了避免過量的防御轉(zhuǎn)錄反應(yīng)影響自身的營養(yǎng)生長，植物在識(shí)別出不同的病原體后會(huì)采用一種特定的防御途徑。不同激素信號(hào)通路之間的相互交叉作用為植物平衡生長和防御的能量分配提供了可能性。通常情況下，茉莉酸和乙烯信號(hào)途徑通過MYC2和EIN3協(xié)同誘導(dǎo)下游防御基因PDF1.2的表達(dá)，增強(qiáng)植物對(duì)死體營養(yǎng)病原菌的抵抗性，而水楊酸則介導(dǎo)對(duì)活體營養(yǎng)和半活體營養(yǎng)病原菌的廣譜抗性。茉莉酸信號(hào)通路和水楊酸信號(hào)通路之間主要表現(xiàn)出拮抗作用。MYC2轉(zhuǎn)錄因子能夠與NAC轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子結(jié)合，激活NAC轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，NAC轉(zhuǎn)錄因子的基因抑制了水楊酸生物合成相關(guān)酶ICS的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)表達(dá)了能夠誘導(dǎo)水楊酸失活的苯甲酸/水楊酸羧甲基轉(zhuǎn)移成酶的表達(dá)，進(jìn)而抑制水楊酸的合成和積累。丁香假單胞菌是一種半活體營養(yǎng)病原菌，植物對(duì)丁香假單胞菌的防御反應(yīng)依靠水楊酸信號(hào)通路。S.Panchal等比較了夜間環(huán)境下Pto處理葉片和外源COR處理葉片的氣孔開口寬度差異，發(fā)現(xiàn)Pto分泌的COR與1.5μmol/L濃度外源COR處理誘導(dǎo)的氣孔開口寬度相當(dāng)，由此可以假設(shè)細(xì)菌侵染過程中產(chǎn)生的COR生物濃度為1.5μmol/L，該濃度與本次試驗(yàn)中的高濃度梯度相當(dāng)。本研究結(jié)果表明高濃度COR能夠激活乙烯和茉莉酸信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)而抑制水楊酸信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)，因此，推測(cè)在丁香假單胞菌侵染過程中，細(xì)菌通過分泌高濃度的COR劫持乙烯/茉莉酸途徑，進(jìn)而削弱依賴于水楊酸的植物防御反應(yīng)。
分別接種Pto和cor-到番茄葉片中，一定時(shí)間后取樣檢測(cè)番茄葉片中的細(xì)菌生長，結(jié)果顯示能夠分泌冠菌素的野生型菌株P(guān)to在葉片中的生長能力遠(yuǎn)強(qiáng)于不能分泌冠菌素的突變株cor-，表明COR增強(qiáng)了細(xì)菌在葉片中的寄生能力，從而增強(qiáng)了細(xì)菌致病性。胼胝質(zhì)是一種無定型的高分子量β-1,3-葡萄糖聚合物，能夠在病原體侵染早期在入侵部位沉積，形成有效的物理屏障，增強(qiáng)植物的細(xì)胞壁防御。通常認(rèn)為，胼胝質(zhì)沉積是由病原體相關(guān)分子模式觸發(fā)引起的植物防御，用純化的丁香假單胞菌鞭毛蛋白的保守肽flg22處理葉片可以誘導(dǎo)胼胝質(zhì)沉積。病菌通過一些效應(yīng)蛋白因子作用于宿主植物，能夠抑制胼胝質(zhì)沉積，比如flg22激活的胼胝質(zhì)沉積就受到丁香假單胞菌分泌的效應(yīng)蛋白的抑制。本試驗(yàn)中的胼胝質(zhì)染色觀測(cè)結(jié)果顯示，相較于對(duì)照處理，野生型菌株P(guān)to和突變株cor-均能顯著誘導(dǎo)番茄葉片的胼胝質(zhì)沉積，但Pto誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)沉積數(shù)量顯著少于cor-誘導(dǎo)的胼胝質(zhì)沉積，表明COR也能夠抑制植物胼胝質(zhì)沉積。
綜上，本研究揭示不同濃度COR對(duì)番茄葉片防御基因的調(diào)節(jié)作用，各濃度的COR處理均能激活乙烯信號(hào)傳導(dǎo)途徑，且高濃度時(shí)這種誘導(dǎo)效應(yīng)最強(qiáng)；COR處理激活了PAL5基因的表達(dá)，抑制了PR1a基因的表達(dá)；COR在高濃度時(shí)會(huì)促進(jìn)番茄茉莉酸合成和信號(hào)傳導(dǎo)，而在低濃度時(shí)抑制茉莉酸相關(guān)基因的表達(dá)。本研究結(jié)果證明了COR在丁香假單胞菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用。一方面，細(xì)菌可能通過分泌高濃度的COR，促進(jìn)了乙烯/茉莉酸途徑，以此拮抗水楊酸途徑；另一方面，細(xì)菌分泌的COR能夠顯著減少葉片中的胼胝質(zhì)沉積數(shù)量。因此，COR作為一種毒性因子促進(jìn)細(xì)菌削弱了宿主防御，從而促進(jìn)病原菌的生長。
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