結(jié)果
攜帶多個(gè)質(zhì)粒編碼rovM拷貝的鼠疫耶爾森菌菌株響應(yīng)營養(yǎng)線索顯示差異化的生物膜形成RovM在大腸桿菌（LrhA）和菊歐文氏菌（PecT）中的同源物已被暗示參與調(diào)節(jié)聚集和生物膜產(chǎn)生所需的基因。與在多拷貝質(zhì)粒上克隆的rovM同源物相關(guān)的過表達(dá)與異常表型有關(guān)，而野生型和突變株表現(xiàn)出相同的表型，例如，在低拷貝數(shù)質(zhì)粒上過表達(dá)lrhA導(dǎo)致大腸桿菌運(yùn)動(dòng)性喪失，而ΔlrhA突變體和野生型仍保持運(yùn)動(dòng)性。
因此，評(píng)估了ΔrovM突變株在聚苯乙烯微孔板上成功產(chǎn)生生物膜的能力，與野生型、以及轉(zhuǎn)化了攜帶rovM基因的質(zhì)粒的野生型和ΔrovM突變株（野生型（pCR_rovM）、ΔrovM（pACrovM）和ΔrovM（pCR_rovM））進(jìn)行比較。ΔrovM突變體在LB（4mM MgCl2，4mM CaCl2）培養(yǎng)基中產(chǎn)生的附著生物膜量與攜帶高或低拷貝數(shù)空質(zhì)粒的野生型菌株相似。有趣的是，轉(zhuǎn)化了pCR_rovM或pACrovM的野生型和ΔrovM菌株，即它們含有多個(gè)rovM基因拷貝，似乎產(chǎn)生同樣減少的生物膜，但這歸因于較少的附著生物膜容易被洗掉。在LB培養(yǎng)基和TMH培養(yǎng)基（補(bǔ)充0.2%半乳糖）中的生長分析表明，野生型（pCR_rovM）、ΔrovM（pCR_rovM）和ΔrovM（pACrovM）的生長速率顯著快于野生型和rovM突變體。
當(dāng)在TMH-gal+培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，野生型（pCR_rovM）和ΔrovM（pACrovM）菌株產(chǎn)生的生物膜量相對(duì)于攜帶空質(zhì)粒的野生型和ΔrovM突變株要多。不同的是，在TMH-gal+培養(yǎng)基中，觀察到較少的附著生物膜并不是造成這種差異的原因。
ΔrovM突變體在跳蚤體內(nèi)具有競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)性劣勢(shì)
昆蟲病原體發(fā)光光桿菌和嗜線蟲致病桿菌的RovM同源物L(fēng)rhA和HexA，在感染各自昆蟲宿主期間調(diào)節(jié)毒力因子表達(dá)、免疫抑制和代謝利用。我們觀察到在不同營養(yǎng)環(huán)境中過表達(dá)rovM的菌株存在差異化的生物膜形成。因此我們預(yù)測(cè)，如果鼠疫耶爾森菌的RovM在跳蚤感染期間保持類似作用，那么其缺失可能會(huì)影響生長、存活和/或生物膜介導(dǎo)的腸道阻塞。
因此，評(píng)估了鼠疫耶爾森菌ΔrovM突變株成功感染跳蚤并產(chǎn)生生物膜阻塞的能力。在跳蚤感染期間，野生型、ΔrovM突變體和互補(bǔ)突變體ΔrovM（pACrovM）菌株表現(xiàn)出可比較的生物膜阻塞、感染率、每只跳蚤的平均細(xì)菌負(fù)荷和跳蚤死亡率（數(shù)據(jù)未顯示）。
如果鼠疫耶爾森菌缺失了一個(gè)對(duì)其在跳蚤腸道適應(yīng)很重要的基因產(chǎn)物，其競(jìng)爭(zhēng)相互作用可能導(dǎo)致適應(yīng)性缺陷，從而影響感染。因此，為了研究RovM突變是否帶來任何潛在的不利條件，進(jìn)行了該突變體與其同基因野生型菌株的競(jìng)爭(zhēng)性共感染。用野生型和ΔrovM突變體或ΔrovM（pACrovM）菌株以1:1的比例共感染一組跳蚤。
在與野生型共感染期間，盡管在感染后第0天ΔrovM突變體的感染負(fù)荷顯著增加，但在感染后第28天觀察到ΔrovM突變體跳蚤感染負(fù)荷顯著下降。相反，在與野生型菌株共感染期間，ΔrovM pACrovM菌株在28天共感染時(shí)顯示出顯著增加的感染負(fù)荷。
RovM響應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)生長
嗜線蟲致病桿菌的LrhA突變體表現(xiàn)出代謝缺陷，影響其感染昆蟲宿主的能力，預(yù)示該調(diào)節(jié)因子感知其宿主環(huán)境的營養(yǎng)組成。為了確定鼠疫耶爾森菌的RovM是否類似地參與代謝過程，在非常基礎(chǔ)的最低培養(yǎng)基SMM中，補(bǔ)充了SMM中通常不含的糖和氨基酸后，對(duì)野生型、ΔrovM突變體和互補(bǔ)突變體ΔrovM（pACrovM）進(jìn)行了生長分析。向培養(yǎng)基中添加葡萄糖和半乳糖導(dǎo)致菌株間生長速率沒有觀察到差異，然而，添加二乙酰殼二糖導(dǎo)致ΔrovM（pACrovM）菌株的生長速率顯著高于rovM突變體和野生型菌株。添加麥芽糖和阿拉伯糖顯示菌株間生長速率無差異（數(shù)據(jù)未顯示）。
預(yù)測(cè)鼠疫耶爾森菌在跳蚤腸道中主要利用L-谷氨酸組氨基酸（脯氨酸、組氨酸、精氨酸、谷氨酰胺）來支持生長，因此測(cè)試了組氨酸、精氨酸和谷氨酰胺支持鼠疫耶爾森菌在SMM中改善生長的能力。有趣的是，雖然ΔrovM突變體和野生型在谷氨酰胺和精氨酸中生長相似，但ΔrovM（pACrovM）菌株在補(bǔ)充這些氨基酸時(shí)似乎具有顯著增強(qiáng)的生長速率。然而，添加組氨酸支持所有菌株的同等生長速率。
特定的營養(yǎng)環(huán)境指導(dǎo)rovM的誘導(dǎo)和RovM相關(guān)的rovA抑制
在假結(jié)核耶爾森菌中，RovM調(diào)節(jié)因子在基本營養(yǎng)環(huán)境中特異性抑制rovA，而在鼠疫耶爾森菌中，rovM被高度誘導(dǎo)，而rovA在跳蚤體內(nèi)被高度抑制。我們假設(shè)在鼠疫耶爾森菌中，類似且特定的營養(yǎng)環(huán)境會(huì)導(dǎo)致RovM抑制rovA，并且這包括跳蚤腸道。然而，對(duì)ΔrovM突變株跳蚤感染的基因表達(dá)分析顯示，野生型和ΔrovM突變體之間rovA表達(dá)沒有顯著差異。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，還確定了鼠疫耶爾森菌rovA和rovM響應(yīng)不同營養(yǎng)環(huán)境的體外轉(zhuǎn)錄水平。進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)是為了確定rovM和rovA的誘導(dǎo)環(huán)境，以及在某些營養(yǎng)環(huán)境中兩者之間是否存在相互調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)。在鼠疫耶爾森菌中，與豐富的LB培養(yǎng)基相比，rovM基因在基本SMM培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄水平較低。rovA轉(zhuǎn)錄水平比rovM高約3倍，并且在兩種培養(yǎng)基中，野生型和ΔrovM突變體之間的rovA水平?jīng)]有差異。
然而，ΔrovM（pACrovM）菌株在LB和SMM葡萄糖中，相對(duì)于在相同培養(yǎng)基中生長的野生型，rovM基因表達(dá)分別增加了約49倍和約22倍。同時(shí)，在LB培養(yǎng)基在rovM過表達(dá)的菌株△rovM（pACrovM）中，rovA的表達(dá)在LB培養(yǎng)基中被抑制約3倍，但在SMM葡萄糖中未注意到rovA表達(dá)差異。然而，在基本SMM培養(yǎng)基補(bǔ)充葡萄糖的情況下，rovA的水平不受rovM影響。
精氨酸被RovM感知以調(diào)節(jié)生長適應(yīng)性和生物膜生產(chǎn)
向SMM補(bǔ)充精氨酸作為新的氮源導(dǎo)致△rovM（pACrovM）菌株的生長速率增加。預(yù)測(cè)精氨酸在跳蚤腸道中被鼠疫耶爾森菌分解代謝，因此測(cè)試了野生型、△rovM突變體和互補(bǔ)突變體△rovM（pACrovM）在生物膜生產(chǎn)背景下響應(yīng)精氨酸的能力。在TMH-gal+arg培養(yǎng)基中缺乏精氨酸，導(dǎo)致具有多個(gè)rovM拷貝的菌株，即△rovM（pACrovM）和野生型（pCR_rovM）的生物膜形成顯著減少。然而，野生型和△rovM突變株無論TMH培養(yǎng)基中是否存在精氨酸，都能產(chǎn)生可比較量的生物膜。
在TMH-gal+arg培養(yǎng)基中，攜帶多個(gè)rovM拷貝的菌株的生長速率高于野生型和△rovM突變體，類似于在TMH-gal+中的生長。為了評(píng)估是否存在精氨酸時(shí)rovM轉(zhuǎn)錄的差異，測(cè)定了在補(bǔ)充精氨酸的SMM培養(yǎng)基中rovM的表達(dá)水平。添加精氨酸并未導(dǎo)致rovM誘導(dǎo)，如野生型菌株在SMM加葡萄糖和SMM加精氨酸中rovM的相似表達(dá)水平所示。然而，在SMM精氨酸培養(yǎng)基中，△rovM（pACrovM）和野生型（pCR_rovM）菌株中發(fā)生rovM過表達(dá)，并伴隨著rovA抑制，這與在LB培養(yǎng)基中發(fā)生的情況一致。
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