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作為植物病原菌分泌毒力因子的重要裝置，分泌系統(tǒng)一直以來都是病原細(xì)菌研究的熱點(diǎn)，其中T3SS在各型分泌系統(tǒng)中研究較多。革蘭氏陰性動植物病原菌利用T3SS將效應(yīng)蛋白注入真核宿主細(xì)胞中，跨膜T3SS裝置和ATP酶有關(guān)，ATP酶可為分泌過程提供能量。hrcN基因表達(dá)產(chǎn)物為ATP酶，該酶在細(xì)菌內(nèi)膜上形成一個與分泌器相關(guān)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并在效應(yīng)蛋白的分泌過程提供能量，對T3SS和細(xì)菌的致病性是必不可少的。hrcN基因敲除后對致病力等表型的影響還未見報(bào)道，但與HrcN蛋白具有相同功能的InvC蛋白基因敲除后，突變株較野生型菌株毒力與定殖率皆顯著降低。InvC與大腸桿菌F0/F1-ATPase具有催化功能的β亞基氨基酸序列相似程度很高，invC基因突變后其蛋白水解ATP的能力喪失，突變體分析進(jìn)一步鑒定出InvC參與核苷酸水解和膜結(jié)合的氨基酸序列。本研究以青枯雷爾氏菌T3SS的hrcN基因?yàn)檠芯繉ο?，該基因是AAA+ATPase家族成員之一，產(chǎn)物為ATP酶。利用同源重組技術(shù)得到了hrcN基因部分缺失突變株，發(fā)現(xiàn)突變株較野生型菌株的致病力下降，病程延長，與青枯雷爾氏菌T3SS效應(yīng)蛋白基因Rip56敲除后致病力測定結(jié)果相似。結(jié)果表明hrcN是青枯雷爾氏菌的致病基因之一，影響T3SS效應(yīng)蛋白的分泌。
接種試驗(yàn)表明，hrcN基因突變株導(dǎo)致青枯雷爾氏菌對番茄的致病力下降，為了充分研究基因功能，進(jìn)一步對其生長速率、生物被膜和運(yùn)動性等基礎(chǔ)生物學(xué)特性進(jìn)行探究。Kanda等測定了煙草青枯雷爾氏菌的生長曲線結(jié)果顯示，不管在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基或者富營養(yǎng)培養(yǎng)基上，野生型菌株與hrpB基因突變株生長速率基本一致。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生型菌株、hrcN基因突變株和回補(bǔ)菌株在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上的生長速率基本一致，在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上，hrcN基因突變株比野生型菌株生長更快，這與Kanda等的研究結(jié)論不一致。在貧營養(yǎng)培養(yǎng)基上突變株比野生型菌株生長更快的文獻(xiàn)還未見報(bào)道，對番茄青枯雷爾氏菌hrcN基因突變后的代謝是否產(chǎn)生變化尚未可知，需進(jìn)一步通過組學(xué)等技術(shù)探究其原因。
病原菌通過自身的運(yùn)動獲得了更大的生存空間，鞭毛等器官可為其提供運(yùn)動能力。通過運(yùn)動性病原菌對有利或不利的環(huán)境快速做出響應(yīng)，避開有害的環(huán)境，接近有利的宿主附近，擴(kuò)大生存范圍。運(yùn)動性能夠促使植物病原菌在侵染初期識別、吸附和入侵宿主植物并進(jìn)行定殖和擴(kuò)展，提高病原菌的致病能力，而運(yùn)動性對病原菌入侵植物后的階段不起作用。此次研究發(fā)現(xiàn)hrcN基因敲除后對番茄青枯雷爾氏菌的運(yùn)動能力沒有影響，而敲除spoT和relA基因后對青枯雷爾氏菌的運(yùn)動能力影響很大。
生物被膜作為保護(hù)細(xì)菌的生物活性膜，能夠形成在非有機(jī)體和有機(jī)體的表面。其主要成分為蛋白質(zhì)、胞外多糖、脂質(zhì)和胞外DNA等，是一種復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)。當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變，細(xì)菌形成生物被膜可以保持水分，通過調(diào)節(jié)代謝降低營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，從而有助于細(xì)菌存活。細(xì)菌形成的生物被膜將自身包圍，處于其中的細(xì)菌相互彼此接觸，影響許多微生物的生存與定殖，比如植物病原細(xì)菌通過昆蟲傳播、直接侵入或從受傷部位入侵植物組織，利用生物被膜增強(qiáng)在植物根、莖、葉和種子等部位的定殖與生存，通過阻塞植物木質(zhì)部導(dǎo)管和維管束組織，引起組織損傷，破壞被感染的組織，造成植物萎蔫。
玉米細(xì)菌性萎蔫病病原菌Pantoeastewartii、馬鈴薯軟腐病病原菌Pectobacterium carotovorumbrasiliense和油菜黑腐病病原菌Xanthomonas campestris等的生物被膜能夠阻塞植物木質(zhì)部導(dǎo)管和維管束組織，引起組織損傷，破壞被感染的組織，造成植物萎蔫。研究還發(fā)現(xiàn)，柑橘潰瘍病病原菌Xanthomonas citri的T3SShrpB缺失突變株不能在柑橘葉片表面聚集，喪失生物被膜的形成能力，革蘭氏陰性菌Acidovorax citrulli的4個Ⅵ型分泌系統(tǒng)基因突變株在甜瓜種子上形成生物被膜和定殖的能力降低，某些分泌系統(tǒng)與生物被膜形成和細(xì)胞聚集有關(guān)。
本研究發(fā)現(xiàn)hrcN基因突變株相比于野生型菌株，生物被膜形成能力顯著減弱，結(jié)合hrcN基因突變株致病力降低，說明hrcN基因敲除后，番茄青枯雷爾氏菌生物被膜形成能力降低，番茄木質(zhì)部導(dǎo)管阻塞程度減弱，萎蔫減輕，病情指數(shù)降低。本研究為后續(xù)探究青枯菌T3SS的功能及其致病機(jī)制提供基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌hrcN基因敲除后菌株毒性減弱，未來可以作為青枯病的生防菌株，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
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