摘要：【目的】篩選并分離出能裂解腸侵襲性大腸埃希菌噬菌體，分析其生物學(xué)特性，并探究其對(duì)污染豬肉的殺菌作用?！痉椒ā坎捎秒p層平板法分離鑒定噬菌體，并測(cè)定其最佳感染復(fù)數(shù)，一步生長(zhǎng)曲線等，對(duì)其基因組進(jìn)行測(cè)序分析以及裂解功效的測(cè)定?！窘Y(jié)果】從醫(yī)院污水中分離鑒定能特異裂解腸侵襲性大腸埃希菌（Enteroinvasive Escherichia coli coli，EIEC）的噬菌體并命名為DK-13，其呈典型的蝌蚪狀外形，包含一個(gè)正二十面體的頭部和一個(gè)可收縮的螺旋對(duì)稱的尾部，屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae）噬菌體；生物學(xué)特性表明：最佳感染復(fù)數(shù)為0.01，潛伏期約為10 min，裂解期約為70 min，噬菌體DK-13能在50℃，pH 5.0-10.0條件下存活。全基因組測(cè)序表明，噬菌體基因組長(zhǎng)約172 275 bp，GC含量為40.18%，預(yù)測(cè)其共有293個(gè)開放閱讀框（open reading frames,ORF）,未發(fā)現(xiàn)已知耐藥基因和毒力基因。應(yīng)用試驗(yàn)表明：被污染的豬肉中表現(xiàn)的殺菌效果良好，宿主菌的數(shù)量明顯減少。【結(jié)論】分離并鑒定一株新的烈性噬菌體DK-13，DK-13具有潛伏期短、裂解效率高等優(yōu)勢(shì)，在食品安全方面具有很大應(yīng)用潛力。
大腸埃希菌（Escherichia coli,E.coli）屬于革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于自然界中，絕大多數(shù)屬于正常菌群，但其在具有某些特定毒力因子時(shí)具有致病性，能引起人和動(dòng)物共同感染。且可通過污染被屠宰動(dòng)物或其他動(dòng)物源性食品等途徑從食物鏈感染人體，可引起腹部絞痛，帶血和黏液的腹瀉等癥狀。抗生素一直是抗菌的重要手段之一，但由于抗生素的濫用，耐藥菌株的大量出現(xiàn)，導(dǎo)致了未來沒有針對(duì)耐藥菌的藥物可用的情況。因此迫切需要開發(fā)具有替代作用的新的抗菌策略。
噬菌體在自然界中種類繁多，具有高度多樣化，基本感染現(xiàn)存的所有細(xì)菌。其基因組編碼的蛋白質(zhì)可用于食品安全防治、耐藥菌株引起的感染治療等。噬菌體還被發(fā)現(xiàn)在對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的牲畜的殺菌方面有較好的效果，從而限制病原體進(jìn)入食物鏈的風(fēng)險(xiǎn)，還可用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的病原體。例如，噬菌體產(chǎn)品SalmoFreshTM和EcoShiledTM已被開發(fā)并批準(zhǔn)用于食品工業(yè)，以抑制食源性微生物。噬菌體裂解細(xì)菌的功效已經(jīng)在各種研究中得到證實(shí)，使用噬菌體成為用于食品安全防治的有效方法。由于多數(shù)噬菌體裂解宿主菌的專一性，需篩選并分離新的噬菌體以擴(kuò)增噬菌體庫(kù)以增加宿主范圍，為未來雞尾酒噬菌體制劑應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。
本研究分離得到一株特異性較強(qiáng)的能裂解腸侵襲性大腸埃希菌的噬菌體，是一種潛伏期短、裂解效率高、耐高溫以及耐酸堿的烈性噬菌體，具有應(yīng)用于食品安全防治的潛力，為以后解決食品污染問題提供了一種新的解決策略。另外本研究還進(jìn)行全基因組測(cè)序并分析預(yù)測(cè)了裂解宿主菌的相關(guān)基因，為進(jìn)一步研究噬菌體應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株和污水樣品
宿主菌腸侵襲性大腸埃希菌D1從污染肉制品分離，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系保存，經(jīng)PCR鑒定為腸侵襲性大腸埃希菌，實(shí)驗(yàn)所用其他大腸埃希菌，蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌均由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系保存。
污水樣品采集于吉林大學(xué)第一醫(yī)院污水處理中心。
1.1.2培養(yǎng)基、主要試劑和儀器
營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、改良克氏雙糖鐵培養(yǎng)基管，青島高科園海博技術(shù)有限公司；聚乙二醇（PEG8000），Beijing Biotopped Science；DNaseI酶，RNaseA酶，大連TaKaRa公司；SM緩沖液，武漢卡諾斯科技有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris堿,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；無水乙醇、冰醋酸，天津市化學(xué)試劑有限公司；硫酸，錦州古城化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，湖北鑫潤(rùn)德化工有限公司。
1.2方法
1.2.1宿主菌的分離與鑒定
吸取20μL EIEC凍干粉溶解液加入10 mL NB中，37℃，160 r/min培養(yǎng)5 h后，用無菌接種環(huán)蘸取菌液進(jìn)行分區(qū)劃線，過夜37℃培養(yǎng)，第2天觀察形態(tài)，挑取單菌落加入NB中培養(yǎng)后保存。挑取EIEC單菌落進(jìn)行PCR確認(rèn)試驗(yàn)以鑒定。
1.2.2裂解性噬菌體的初步篩選
將未經(jīng)處理的醫(yī)院污水取出300 mL加入1.8 g固體CaCl2（0.6%）靜置30 min，5 000 r/min離心10 min，取100 mL的污水上清液和100 mL NB，并與5 mL EIEC的新鮮菌液混合，37℃培養(yǎng)過夜。次日5 000 r/min離心3 min，經(jīng)0.45μm濾器過濾后得到噬菌體初提液。取500μL EIEC菌液加入試管中，再加入5 mL半固體培養(yǎng)基（50℃左右），凝固后在表面中心處滴加2-3滴噬菌體初提液，晾干后倒置放入培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)過夜。次日觀察平板中心是否出現(xiàn)噬菌斑。
1.2.3噬菌體的分離純化及測(cè)定滴度
挑出形態(tài)最好的噬菌斑加入宿主菌液中培養(yǎng)8 h，5 000 r/min離心3 min，所得上清液用0.45μm濾器過濾，得到噬菌體純化液。取100μL噬菌體液倍比稀釋液與100μL宿主菌液混合于試管中，再加入5 mL半固體培養(yǎng)基（50℃左右），混勻后倒在瓊脂平板上，凝固后37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日觀察平板上的噬菌斑形態(tài)，挑取單個(gè)噬菌斑重復(fù)上述操作7-10次，最終得到純化后的純種噬菌體。
將純化后的噬菌體液進(jìn)行倍比稀釋，重復(fù)一次純化的步驟，37℃恒溫培養(yǎng)過夜后，次日觀察并記錄各稀釋梯度平板上噬菌斑的數(shù)量，依據(jù)公式算出噬菌體的滴度。
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