摘要：在木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理過程中不可避免地形成抑制劑，包括糖降解產(chǎn)物(如5-羥甲基糠醛、糠醛)以及木質(zhì)素降解的酚類化合物(如4-羥基苯甲酸、香蘭素)等，這些化合物會(huì)降低發(fā)酵效率。[目的]提高酵母對(duì)纖維素水解液中的抑制物耐受性對(duì)工業(yè)生物質(zhì)乙醇高效生產(chǎn)至關(guān)重要。[方法]采用濃度較高的糠醛和對(duì)羥基苯甲酸對(duì)模式菌株W303-1A進(jìn)行梯度馴化，對(duì)比馴化菌株和出發(fā)菌株在不同抑制物濃度下的生長(zhǎng)曲線及發(fā)酵乙醇性能；對(duì)馴化后菌株和出發(fā)菌株進(jìn)行高通量基因組重測(cè)序，分析其糖代謝途徑和耐藥性相關(guān)的變異點(diǎn)基因，對(duì)與耐抑制物有關(guān)的變異點(diǎn)進(jìn)行分析挖掘。[結(jié)果]在含有2.0 g/L糠醛的培養(yǎng)基中，F(xiàn)-2菌的乙醇產(chǎn)量為19.40 g/L，比原始菌株高2倍。在含有1.6 g/L糠醛和對(duì)羥基苯甲酸的培養(yǎng)基中，B-2菌的最高乙醇產(chǎn)量為20.22 g/L，是原始菌株的7.6倍。通過對(duì)出發(fā)菌株和馴化后菌株進(jìn)行高通量基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)，糖代謝途徑中編碼乙醇脫氫酶、果糖-1,6-二磷酸醛縮酶和丙酮酸脫氫酶的基因發(fā)生部分突變，而YAP1(參與氧化應(yīng)激反應(yīng)和氧化還原穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄激活劑)、PDR5(耐多種化學(xué)物質(zhì)的多效ABC外運(yùn)載體)和RPN4(鋅指蛋白)基因的部分突變對(duì)釀酒酵母的耐抑制物具有重要作用。[結(jié)論]研究結(jié)果為進(jìn)一步優(yōu)化和構(gòu)建模式菌株提供更多的操作靶點(diǎn)。
過度使用石油等化石燃料帶來的儲(chǔ)量枯竭、溫室氣體排放等問題危害著能源安全和生態(tài)環(huán)境。近年來，生物質(zhì)燃料憑借其原料廉價(jià)、來源豐富且可再生性等受到了廣泛關(guān)注，成為替代能源的新選擇。木質(zhì)纖維素燃料乙醇是二代生物質(zhì)能源，包括農(nóng)林廢棄物、工業(yè)廢殘留物、餐廚垃圾等，可以緩解糧食危機(jī)。利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇要經(jīng)過預(yù)處理過程，然而在此過程中會(huì)產(chǎn)生一些抑制物，嚴(yán)重影響微生物生長(zhǎng)和乙醇得率。抑制物的種類和含量因原料和預(yù)處理方法的不同存在差異，主要分為酚類化合物(香草醛、丁香醛、苯酚等)、酸類化合物(乙酸、甲酸等)和呋喃醛類化合物(糠醛、5-羥甲基糠醛)三大類。其中酚類化合物在纖維素水解液中的含量很低，但其毒性卻很大，且一些低分子含有脂肪族官能團(tuán)的酚類化合物的抑制效果最強(qiáng)。為了降低抑制劑的抑制作用，通常會(huì)選擇在發(fā)酵前脫毒處理，然而此過程復(fù)雜，工業(yè)成本較高，并且會(huì)造成糖分的損失，經(jīng)濟(jì)效益不高。因此，選育抑制物高耐受性的微生物更加經(jīng)濟(jì)有效。
釀酒酵母是傳統(tǒng)乙醇生產(chǎn)工業(yè)中使用的微生物，發(fā)酵效率高并且對(duì)一些毒性物質(zhì)耐受性較強(qiáng)，因此進(jìn)一步選育抑制物高抗性的釀酒酵母對(duì)提高纖維素乙醇生產(chǎn)效率具有重要意義。目前，選育釀酒酵母主要利用誘變篩選、定向梯度馴化、基因工程等手段。誘變篩選是一種簡(jiǎn)單的傳統(tǒng)選育方法，會(huì)產(chǎn)生多種突變，具有較強(qiáng)的隨機(jī)性?；蚬こ淌侄问腔诨蚪M、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組分析，挖掘靶點(diǎn)基因，設(shè)計(jì)出合理的基因改造策略和路線，有針對(duì)性地強(qiáng)化菌株對(duì)抑制劑的耐受性。定向梯度馴化則通過施加外界環(huán)境壓力篩選獲得高耐受力菌株，是自然選擇理想表型性狀突變菌株的有力方法，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)生耐抑制劑的酵母菌株。雖然已獲得多種耐受單一抑制劑的工程菌株，并揭示了其耐受機(jī)理，但實(shí)際水解液的復(fù)合抑制劑作用復(fù)雜，包括累加作用和協(xié)同作用，其作用機(jī)制尚不明了。
本研究選取糠醛和對(duì)羥基苯甲酸作為環(huán)境壓力，對(duì)釀酒酵母W303-1A進(jìn)行單一抑制物和復(fù)合抑制物的定向梯度馴化。得到的耐受菌株在不同抑制物種類和濃度的培養(yǎng)基中驗(yàn)證其生長(zhǎng)和發(fā)酵性能，并通過高通量重測(cè)序分析基因差異，以期找到新的靶點(diǎn)基因，闡明釀酒酵母對(duì)糠醛、對(duì)羥基苯甲酸的代謝通路，揭示其耐受機(jī)制。
1材料與方法
1.1樣品
本研究所用的釀酒酵母菌株為模式菌株W303-1A，購(gòu)自廣州星禾科技生物有限公司，活化后的甘油菌平板劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12?16 h備用。
1.2培養(yǎng)基
YPD活化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0 g，酵母浸粉10.0。121℃滅菌15 min后備用(固體培養(yǎng)基則另添加2%瓊脂粉)。
YPD馴化培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母浸粉10.0。121℃滅菌15 min后備用。分別加入不同劑量過濾除菌的抑制物，抑制物為糠醛或?qū)αu基苯甲酸。
YPD發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50.0，蛋白胨20.0，酵母浸粉10.0。121℃滅菌15 min后備用(可加入不同濃度的抑制物制成檢測(cè)培養(yǎng)基)。
1.3主要試劑
葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；糠醛購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠；對(duì)羥基苯甲酸購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司。
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