2結(jié)果與分析
2.1細(xì)菌分離
20份腦組織分別接種TSA平板，通過挑選可疑菌落，對(duì)其純化，總共分出10株疑似菌株。在平板上可見灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的小菌落。
2.2細(xì)菌鑒定分離
的10株細(xì)菌，用豬鏈球菌屬引物gdh進(jìn)行PCR鑒定，其中3株能擴(kuò)增出約695 bp大小的條帶，分別回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，顯示與豬鏈球菌對(duì)應(yīng)的序列同源性在95%以上，說明分離菌株為豬鏈球菌(圖1)。
2.3 2型豬鏈球菌PCR鑒定
3株豬鏈球菌經(jīng)過cas2J引物PCR鑒定，1株能擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為387 bp大小的條帶，回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)所測(cè)序列片段大小和預(yù)期片段大小相同，同時(shí)把測(cè)出的序列結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，顯示與對(duì)應(yīng)血清型的序列同源性在95%以上，說明所擴(kuò)增的基因即為目的基因(圖2)。
M:DL2000 DNA Marker;1-10:疑似菌株;11:陰性對(duì)照M:DL2000 DNA Marker;1-10:suspicious strain；11:Negative control圖1豬鏈球菌PCR鑒定結(jié)果
M:DL2000 DNA Marker;1-3:豬鏈球菌;4:陰性對(duì)照M:DL2000 DNA Marker;1-3:Streptococcus suis;4:Negative control圖2 2型豬鏈球菌PCR鑒定結(jié)果
2.4毒力因子鑒定
分離的1株2型豬鏈球菌通過PCR檢測(cè)了mrp、epf、sly、orf2、gapdh、fbps和89k 7種毒力因子，結(jié)果7種毒力因子在分離菌株中都能檢測(cè)到(圖3)。對(duì)上述菌株毒力基因測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所測(cè)序列片段大小和預(yù)期片段大小相同，同時(shí)把測(cè)出的序列結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，顯示與對(duì)應(yīng)的毒力因子序列同源性在95%以上，說明所擴(kuò)增的基因即為目的基因，分離菌株基因中幾種主要毒力因子都有分布。
2.5形態(tài)學(xué)特性分離
的2型豬鏈球菌經(jīng)過革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，細(xì)菌為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，具有多種不同形態(tài)，可見單個(gè)的球桿菌、桿菌或絲狀的菌體(圖4)。
2.6生長(zhǎng)曲線繪制
在液體TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離菌株，分離菌6 h左右開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)8～10 h活菌數(shù)達(dá)到最高峰，但從10 h開始活菌數(shù)一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。分離菌株在TSB液體培養(yǎng)基繁殖速度快，活菌數(shù)高(圖5)。
2.7小鼠攻毒試驗(yàn)昆明小鼠腹腔注射不同濃度的菌液后，試驗(yàn)小鼠最早于攻毒后第1天開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡高峰出現(xiàn)在攻毒后2～5 d，7 d后停止死亡。按Reed-Muench法計(jì)算，分離2型豬鏈球菌的LD50見表2。將濃縮菌液稀釋到4.8×107CFU/mL，攻毒0.2 mL，能使半數(shù)小鼠發(fā)生死亡，表明分離菌株毒力較強(qiáng)。
圖4革蘭氏染色結(jié)果(100×)
圖5 2型豬鏈球菌生長(zhǎng)曲線
表2半數(shù)致死量(LD50)試驗(yàn)結(jié)果
2.8剖檢觀察剖檢攻毒死亡小鼠，可見攻毒小鼠腹腔內(nèi)滲出液增多，腦和各臟器出血；試驗(yàn)結(jié)束后剖檢空白對(duì)照組小鼠，可見健康對(duì)照組小鼠腹腔及各器官正常。分離的2型豬鏈球菌能引起小鼠的急性敗血癥及腦膜炎，導(dǎo)致小鼠死亡，成功在小鼠上建立攻毒模型。
2.9臟器細(xì)菌分離
剖檢死亡小鼠，取各臟器在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果顯示攻毒后死亡小鼠各臟器均能分離出細(xì)菌。對(duì)各臟器分離的細(xì)菌進(jìn)行PCR鑒定并測(cè)序，結(jié)果表明各臟器分離菌株均為攻毒2型豬鏈球菌(圖6)。
圖6攻毒小鼠各臟器細(xì)菌分離鑒定
3討論與小結(jié)
豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病病原，其致病性差異很大，只有高致病力菌株才能引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、敗血癥、肺炎和突然死亡等癥狀，低致病力和無(wú)致病力的菌株常見于豬的呼吸道。在致病性血清型中2型的致病力最強(qiáng)，發(fā)病率最高，流行范圍最廣，其致病性和它的毒力因子相關(guān)。現(xiàn)有疫苗菌株分離年代都比較久遠(yuǎn)，保護(hù)效果有一定的降低。本研究采集最近幾年疑似豬鏈球菌感染病例腦樣品，經(jīng)過平板分離和PCR鑒定成功獲得一株2型豬鏈球菌，PCR檢測(cè)顯示分離菌株基因中幾種主要毒力因子都有分布，在TSB液體培養(yǎng)基繁殖速度快，活菌數(shù)高，能引起小鼠的急性敗血癥及腦膜炎導(dǎo)致小鼠死亡，證明分離株毒力強(qiáng)，是潛在的疫苗菌株。
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