2、結(jié)果與討論
2.1菌株的分離鑒定及生長(zhǎng)特性
2.1.1菌株的形態(tài)學(xué)特征
從醬香型白酒堆積酒醅中共篩選到179株菌株，結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和德國(guó)微生物與細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ,https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/DSM-45196)，平板菌落形態(tài)初步確定有3株潛在克羅彭斯特德菌，編號(hào)為K.eburnea 1613、K.eburnea 1615、K.eburnea 6E22，其菌落形態(tài)基本一致，以菌株K.eburnea 1613為例，在TSB固體培養(yǎng)基上45℃培養(yǎng)48 h后，菌落呈象牙色，扁平狀，形態(tài)不規(guī)則，邊緣呈波浪狀，表面無(wú)光澤，生長(zhǎng)到后期菌落呈放射狀，褶皺狀，有土腥味(圖1A)。通過(guò)冷場(chǎng)掃描電鏡觀察，菌株K.eburnea 1613的菌絲呈長(zhǎng)的彎曲狀，在不分枝的菌絲頂端上發(fā)育單個(gè)內(nèi)生孢子，菌絲體大小約(0.3?0.5)μm?(4.0?6.0)μm(圖1B)。
圖1菌株Kroppenstedtia eburnea 1613的菌落形態(tài)(A)和冷場(chǎng)掃描電鏡圖(B)
2.1.2菌株的分子生物學(xué)鑒定
將菌株的16S rRNA基因序列提交到EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)果顯示K.eburnea 1613、K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22均與模式菌株Kroppenstedtia eburnea DSM 45196T相似度最高，分別為99.16%、98.76%和98.95%，與模式菌株Kroppenstedtia guangzhouensis GD02T的相似度分別為95.88%、95.82%和95.61%。已有研究定義潛在新物種的16S rRNA基因序列相似度閾值為98.65%。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示3株菌與Kroppenstedtia eburnea DSM 45196T聚為一支(圖2)。因此，綜合菌株形態(tài)特征和16S rRNA基因序列分析，將菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22鑒定為Kroppenstedtia eburnea。
圖2基于16S rRNA基因序列的鄰近法系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)
2.1.3菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)
生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定結(jié)果表明，3個(gè)菌株在0?16 h生長(zhǎng)速度緩慢，處于延滯期；培養(yǎng)至18 h生長(zhǎng)迅速，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；在32 h左右進(jìn)入平穩(wěn)期，OD600為2.8?3.2。菌株K.eburnea 1613 pH在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中呈上升趨勢(shì)，從初始7.46變化為8.46(圖3B)。菌株K.eburnea 1615、K.eburnea 6E22終點(diǎn)pH值為7.70，與初始pH值相比變化不顯著(P>0.05)。
圖3菌株在45℃、pH 7.50條件下的生長(zhǎng)特性A：OD600.B：pH
2.2菌株發(fā)酵液中揮發(fā)性化合物分析
2.2.1揮發(fā)性化合物大類(lèi)組成
采用HS-SPME-GC-MS方法在菌液中共檢出97種揮發(fā)性化合物，包括17種醇類(lèi)、16種吡嗪類(lèi)、13種醛類(lèi)、12種酮類(lèi)、10種酯類(lèi)、6種酚類(lèi)、5種酸類(lèi)以及18種其他類(lèi)化合物。菌液揮發(fā)性化合物總相對(duì)濃度為(10.05±0.38)–(22.17±1.37)mg/L(圖4A)。與空白對(duì)照組相比，菌株K.eburnea 1613的菌液中揮發(fā)性化合物含量是其1.88倍(P<0.01)，而菌株K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22與對(duì)照差異不顯著(P>0.05)。吡嗪類(lèi)物質(zhì)在各菌株發(fā)酵液中占比最大，為49.68%–70.35%，其中菌株K.eburnea 1613占比最高，達(dá)到70.35%(圖4B)?？瞻讓?duì)照組中吡嗪類(lèi)物質(zhì)含量為(5.45±0.17)mg/L，菌株K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22菌液中吡嗪類(lèi)物質(zhì)濃度分別為(5.95±0.07)mg/L和(6.26±1.19)mg/L，與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，而K.eburnea 1613中吡嗪類(lèi)濃度為(14.53±0.99)mg/L，顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，是對(duì)照組的2.66倍，說(shuō)明菌株K.eburnea 1613能促進(jìn)吡嗪類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生。
圖4菌液揮發(fā)性化合物相對(duì)濃度(A)及百分占比(B)
2.2.2各類(lèi)揮發(fā)性化合物分析
為了比較菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22在純培養(yǎng)條件下的揮發(fā)性化合物含量差異，對(duì)每個(gè)物質(zhì)進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化并繪制成熱圖(圖5)，其中對(duì)照(control)為未接種的空白培養(yǎng)基。3株菌的發(fā)酵液中所含揮發(fā)性化合物的成分有明顯差異，菌株K.eburnea 1613發(fā)酵液中吡嗪類(lèi)、酮類(lèi)、酸類(lèi)、醇類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)普遍明顯高于菌株K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22。
圖5純培養(yǎng)條件下菌株各類(lèi)揮發(fā)性化合物聚類(lèi)熱圖分析
吡嗪類(lèi)物質(zhì)是胺和羰基化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)物之一，空白培養(yǎng)基中吡嗪類(lèi)物質(zhì)占比為49.68%，推測(cè)是由于培養(yǎng)基中物質(zhì)之間發(fā)生美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物。相較于對(duì)照，菌株K.eburnea 1613中檢測(cè)出的2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的含量都顯著上升，分別是其1.5、5.5和16.0倍，再次表明菌株K.eburnea 1613能促進(jìn)吡嗪類(lèi)物質(zhì)的生成。此外，菌株K.eburnea 1613發(fā)酵液中檢出2-壬酮、2-庚酮和2-十一酮等7種酮類(lèi)化合物，而在K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22中未檢出，其中2-壬酮和2-庚酮具有花果香和清甜氣味；酸類(lèi)物質(zhì)僅在K.eburnea 1613發(fā)酵液中檢出，含量為(0.16±0.09)mg/L；醇類(lèi)含量也明顯高于對(duì)照和另外2株菌。菌株K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22中檢出的3,5-二叔丁基苯酚含量高于其他組，分別為(2.01±0.04)mg/L和(2.03±1.18)mg/L。另外，各菌株發(fā)酵液中均檢測(cè)到了不同種類(lèi)的酯類(lèi)物質(zhì)，例如，K.eburnea 1613中檢測(cè)到癸酸甲酯、十三酸甲酯和12-甲基十三烷酸甲酯，這些酯類(lèi)呈花果香的氣味。綜上所述，菌株K.eburnea 1613能顯著提高各類(lèi)揮發(fā)性風(fēng)味化合物的產(chǎn)生，包括吡嗪類(lèi)、酮類(lèi)等，這些物質(zhì)有利于醬香型白酒典型風(fēng)味的形成。
2.3固態(tài)發(fā)酵高粱中揮發(fā)性化合物分析
不同發(fā)酵方式對(duì)于微生物的生長(zhǎng)和代謝具有重要影響，因此，為更好地探究微生物在堆積酒醅中的生長(zhǎng)和代謝特點(diǎn)，進(jìn)一步進(jìn)行了恒溫固態(tài)發(fā)酵高粱實(shí)驗(yàn)。
2.3.1不同溫度固態(tài)發(fā)酵高粱中揮發(fā)性化合物大類(lèi)組成
采用HS-SPME-GC-MS方法在發(fā)酵高粱中共檢出89種揮發(fā)性化合物，包括23種酯類(lèi)、14種酮類(lèi)、11種醛類(lèi)、12種醇類(lèi)、11種酸類(lèi)、2種酚類(lèi)以及16種其他類(lèi)化合物。揮發(fā)性化合物的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖6)。菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22在50℃發(fā)酵15 d時(shí)發(fā)酵高粱中檢出的揮發(fā)性化合物總含量均高于45℃，其中主要為醇類(lèi)和酸類(lèi)，它們的總含量呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。菌株K.eburnea 1615在發(fā)酵第15天時(shí)揮發(fā)性化合物含量最高，45℃和50℃時(shí)分別為(67.79±18.72)μg/g和(72.79±0.58)μg/g(圖6A、6B)。
圖6 45℃(A)和50℃(B)下菌株固態(tài)發(fā)酵高粱中揮發(fā)性化合物相對(duì)含量及其占比
2.3.2不同溫度固態(tài)發(fā)酵高粱中揮發(fā)性化合物分析
為比較菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615和K.eburnea 6E22在不同溫度下的固態(tài)發(fā)酵高粱各類(lèi)揮發(fā)性化合物含量差異，將各類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行Z-score標(biāo)準(zhǔn)化并繪制成熱圖(圖7)。結(jié)果表明，菌株K.eburnea 1615在50℃發(fā)酵15 d時(shí)醇類(lèi)物質(zhì)含量最高，為(33.69±0.34)μg/g，是對(duì)照組的3.08倍，其中含量最高是苯乙醇，含量為(31.17±0.14)μg/g。與對(duì)照相比，3株菌均促進(jìn)了苯乙醇的產(chǎn)生，尤其是K.eburnea 1615(圖7A)。苯乙醇具有玫瑰花香的氣味和抗真菌活性，可能在醬香型白酒堆積過(guò)程中抑制真菌的生長(zhǎng)。高級(jí)醇是指3個(gè)及以上碳原子的一元醇，是白酒中重要的呈味化合物，如苯乙醇、異戊醇等，含量太低會(huì)導(dǎo)致白酒酒體單薄，過(guò)量會(huì)讓酒體苦澀，容易上頭。在白酒釀造中高級(jí)醇的合成主要是氨基酸分解代謝途徑(Ehrlich途徑)和氨基酸合成代謝途徑(Harris途徑)。
圖7恒溫發(fā)酵高粱中不同類(lèi)別揮發(fā)性化合物分析
A：醇類(lèi).B：酸類(lèi).C：酯類(lèi).D：醛類(lèi).E：酮類(lèi).F：其他類(lèi).G：酚類(lèi)
與對(duì)照相比，菌株K.eburnea 1613、K.eburnea 1615在酸類(lèi)物質(zhì)積累上具有明顯優(yōu)勢(shì)，主要為異戊酸，其次是己酸。K.eburnea 1615在第15天時(shí)總含量最高，為(27.50±1.04)μg/g，異戊酸含量為(16.75±0.76)μg/g。酸類(lèi)物質(zhì)具有協(xié)調(diào)香氣的作用，適量的酸可使白酒酒體豐滿(mǎn)、回味悠長(zhǎng)。同時(shí)，酸類(lèi)是合成酯類(lèi)不可或缺的前體，酯類(lèi)物質(zhì)通常具有花香、果香、甜香等愉悅的風(fēng)味特征，對(duì)白酒風(fēng)味有著積極的作用，例如，異戊酸酯化形成的異戊酸乙酯具有似蘋(píng)果等的水果香。此外，相較于45℃，菌株在50℃積累更多酸類(lèi)物質(zhì)。例如，K.eburnea 1615在50℃發(fā)酵15 d時(shí)5-甲基己酸和丁酸的含量分別為(4.41±0.03)μg/g和(0.88±0.01)μg/g，是45℃的1.57倍和1.72倍；菌株K.eburnea 1613在50℃發(fā)酵15 d時(shí)己酸含量為(3.74±0.19)μg/g，是45℃的2.73倍(圖7B)。然而，高溫可能不利于酯類(lèi)物質(zhì)的積累，從總體上看，菌株在50℃發(fā)酵條件下的酯類(lèi)物質(zhì)含量普遍低于45℃(圖7C)。例如，K.eburnea 1615在45℃發(fā)酵7 d時(shí)，酯類(lèi)物質(zhì)含量最高，為(8.01±4.01)μg/g，是50℃的4.97倍。另外，45℃對(duì)照組中部分酯類(lèi)物質(zhì)積累明顯，如棕櫚酸甲酯、癸酸乙酯，可能是高粱原料本身中物質(zhì)轉(zhuǎn)化形成的。
醛酮類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)豐富，主要是發(fā)酵過(guò)程微生物代謝及醇類(lèi)物質(zhì)氧化、酮酸脫酸等產(chǎn)生。醛酮類(lèi)共檢出25種，主要有苯甲醛、壬醛、異佛爾酮和仲辛酮等(圖7D、7E)。苯甲醛和異佛爾酮分別是含量最高的醛類(lèi)和酮類(lèi)，前者具有苦杏仁氣味，后者具有薄荷氣味。固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中醛類(lèi)物質(zhì)總含量無(wú)明顯變化，對(duì)照組中主要的醛類(lèi)物質(zhì)含量高于其他3組，說(shuō)明一定溫度下高粱自身可能會(huì)釋放醛類(lèi)物質(zhì)。然而，3個(gè)菌株組中苯乙醛在發(fā)酵過(guò)程逐漸增加，至15 d時(shí)含量為(0.92?1.32)μg/g，高于對(duì)照組，苯乙醛具有苦杏仁的氣味。酮類(lèi)物質(zhì)在發(fā)酵至15 d時(shí)明顯積累，其中在50℃條件下對(duì)照組中酮類(lèi)含量為(4.92±1.00)μg/g，是45℃的2.03倍，表明50℃可能促進(jìn)高粱原料產(chǎn)生酮類(lèi)物質(zhì)。菌株K.eburnea 1615在45℃發(fā)酵15 d時(shí)酮類(lèi)總量最高，為(5.38±1.30)μg/g，是對(duì)照的2.09倍，其中，異佛爾酮的積累量最高，為(4.82±1.19)μg/g，是對(duì)照的22.95倍。結(jié)果表明，堆積發(fā)酵過(guò)程中高溫有助于醛酮類(lèi)物質(zhì)的積累，菌株K.eburnea 1615在45℃也能提高酮類(lèi)物質(zhì)的含量，推測(cè)醛酮類(lèi)的產(chǎn)生是溫度和微生物共同作用的結(jié)果。
吡嗪類(lèi)物質(zhì)具有典型的烤香味、堅(jiān)果味，被認(rèn)為是醬香型白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)。共檢出4種吡嗪類(lèi)物質(zhì)，含量最高的為2,5-二甲基吡嗪(圖7F)。3個(gè)菌株的2,5-二甲基吡嗪含量均高于對(duì)照組，在50℃下的積累量高于45℃，其中50℃第7天時(shí)菌株K.eburnea 6E22中檢出的2,5-二甲基吡嗪含量最高，為(1.67±0.14)μg/g，是45℃下的1.05倍。高溫有利于美拉德反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生更多的吡嗪類(lèi)物質(zhì)。酚類(lèi)物質(zhì)在對(duì)照組中含量較高，3,5-二叔丁基苯酚在45℃發(fā)酵15 d時(shí)含量最高，為(4.88±0.94)μg/g，可能源于高粱自身物質(zhì)的分解(圖7G)。此外，菌液和發(fā)酵高粱中檢出的揮發(fā)性化合物的含量和種類(lèi)不同，可能是由于底物組成不同造成的，純培養(yǎng)條件中TSB培養(yǎng)基主要以胰蛋白胨和葡萄糖為氮源和碳源，紅纓子高粱中主要是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為69.88%的支鏈淀粉和7.43%蛋白質(zhì)，其次發(fā)酵方式的不同也可能對(duì)微生物的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生影響。綜上所述，象牙色克羅彭斯特德菌有助于堆積發(fā)酵酒醅風(fēng)味化合物的產(chǎn)生，特別是醇類(lèi)、酸類(lèi)和吡嗪類(lèi)等醬香型白酒特征風(fēng)味物質(zhì)。
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長(zhǎng)和揮發(fā)性化合物代謝特征（一）
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長(zhǎng)和揮發(fā)性化合物代謝特征（二）
醬香型白酒堆積酒醅中分離克羅彭斯特德菌生長(zhǎng)和揮發(fā)性化合物代謝特征（三）
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