近年來，鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)的致病率呈上升趨勢，每年造成數(shù)百萬人感染和死亡.沙門菌主要感染腸道，癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、高燒等，重癥者出現(xiàn)死亡.
外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)是革蘭氏陰性細菌外膜(outer membrane,OM)的主要蛋白質(zhì)成分,該類蛋白質(zhì)在調(diào)控細胞結構和形態(tài)、營養(yǎng)獲取、定殖和入侵以及防止抗生素等外部威脅方面發(fā)揮著關鍵作用.Heffernan et al研究發(fā)現(xiàn)，Rck基因座與革蘭氏陰性菌中表達的外膜蛋白家族同源，其中2種與毒力表型相關：PagC，能提高鼠傷寒沙門菌在巨噬細胞中的存活率和毒力；Ail，是一種耶爾森氏菌染色體的產(chǎn)物，能夠介導細菌黏附和侵入上皮細胞系.Xu et al發(fā)現(xiàn)，OMP的表達有助于幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)在感染初級階段附著在胃上皮細胞上，并能增加該菌的毒力.一些來自不同革蘭氏陰性細菌的OMP已被確認為宿主免疫識別的重要因素，可參與細菌多種生命活動，具有開發(fā)為疫苗的潛力.
小RNA(small RNA,sRNA)是一類可對mRNA進行調(diào)控的重要因子，參與細菌多種生命過程，如調(diào)節(jié)毒力、適應環(huán)境變化、調(diào)節(jié)OMP基因的表達等；同時，sRNA對mRNA的調(diào)節(jié)作用往往需要伴侶蛋白Hfq參與.Hfq在細菌生理功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著多種作用：除了協(xié)同sRNA共同作用外，還能夠單獨調(diào)節(jié)細菌多種基因的表達，對細菌生長、毒力、侵襲力等有影響.Sittka et al研究表明,Hfq參與兼性細胞內(nèi)病原體鼠傷寒沙門菌毒力因子的表達和分泌.sRNA和Hfq可對大量的mRNA和蛋白進行調(diào)控，進而影響細菌的致病性.
FadL、OmpN、YbfM在沙門菌中均參與外膜蛋白的合成、轉運、識別等過程，Hfq及sRNA RybB也被確定能對以上3個OMP基因產(chǎn)生一定的調(diào)控作用.但外膜蛋白FadL、OmpN、YbfM及伴侶蛋白Hfq和sRNA RybB對沙門菌致病性的影響并未完全明確.本試驗利用實驗室前期構建的鼠傷寒沙門菌基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB&Δhfq研究其對該菌致病性的影響，旨在為了解這些基因?qū)ι抽T菌致病性的作用機制提供依據(jù).
1材料與方法
1.1供試菌株
表1缺失菌株基因型
鼠傷寒沙門菌標準菌株LT2由法國國家科學研究中心(CNRS)分子遺傳學Bossi實驗室惠贈；鼠傷寒沙門菌缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB&Δhfq均由貴州省動物疫病研究室構建.缺失菌株基因型如表1所示.
1.2供試動物
無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級KM系雄性小鼠，18～22 g，4～6周齡，購自遼寧長生生物技術股份有限公司.在特定的無病原體條件下養(yǎng)殖小鼠，提供充足的食物和水.試驗已通過貴州大學動物倫理和福利委員會批準(編號：EAE-GZU-2021-E005).
1.3鼠傷寒沙門菌生長曲線的測定
將鼠傷寒沙門菌標準菌株LT2及基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB&Δhfq分別接種于LB平板中復蘇培養(yǎng)，挑取平板上單個菌落接種于液體LB中，37℃搖床中培養(yǎng)過夜.次日，通過紫外分光光度計(Q-5000)調(diào)整菌株的D600 nm=0.1，按照1∶100的比例取500μL菌液接種于50 mL液體LB中，37℃、170 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每隔1 h取1 mL細菌懸浮液，通過紫外分光光度計測D600 nm值.統(tǒng)計結果，并制作生長曲線圖.
1.4鼠傷寒沙門菌的毒力測定
將鼠傷寒沙門菌標準菌株LT2及基因缺失菌株ΔompN、ΔfadL、ΔybfM、Δhfq、ΔrybB、ΔrybB&Δhfq分別接種于5 mL液體LB中，37℃搖床中培養(yǎng)過夜.次日，取100μL菌液至新的LB試管中，培養(yǎng)10 h，將菌液12 000 r·min-1離心5 min，棄掉上清液，通過無菌PBS重懸浮洗滌，調(diào)整菌液濃度至1×109CFU·mL-1，再梯度稀釋為1×108、1×107、1×106、1×105CFU·mL-1.將小鼠隨機分組，每組5只，腹腔注射菌液0.5 mL·只-1，以注射相同劑量PBS為空白組.連續(xù)15 d觀察、記錄小鼠死亡數(shù)，通過改良寇式法計算各菌株對應的LD50.
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