本次研究以大青葉作為輔料，探討添加大青葉對酒曲發(fā)酵的影響。結果表明，添加大青葉使培養(yǎng)基質密度降低、基質疏松，有利于發(fā)酵過程的通氣和傳熱，發(fā)酵后酸度下降。添加大青葉促進酒曲中霉菌的生長，但抑制細菌和酵母生長，并導致生物活性發(fā)生變化，影響效果與大青葉的添加量成正比，當添加量為9%時，糖化酶酶活提高4.24倍，液化酶活、發(fā)酵力、酯化力等分別下降30%、90%和80%。同時，添加大青葉使酒曲成品的揮發(fā)性成分明顯增多，酯類物質從4種增加至8種，還增加了苯甲醇和多種高級脂肪酸、烷烴、烯烴、酰胺、醇等物質，這些新增物質將會對酒曲風味產生較大影響。
酒曲作為酒釀造過程中的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑，其質量的好壞對酒的風味、產率和品質具有極大的影響。傳統(tǒng)酒曲制作多添加中草藥作為輔料（如桑葉、野蓼等），少的添加1種，多的甚至上百種。添加方法有破碎后直接添加或熱水浸煮后取浸提液添加。添加的中草藥為酒曲提供植物中的微生物、蛋白質、芳香成分及有毒（抑菌）成分，但對于添加中草藥在酒曲制作過程中的作用機理少見報道。
大青葉是我國是傳統(tǒng)的清熱解毒中草藥，具有抗病毒、抗內毒素和抑菌活性，臨床主要用于流行性感冒、急性傳染性肝炎、痢疾、急性腸胃炎、發(fā)斑發(fā)疹等疾病。以往對大青葉的研究主要在醫(yī)藥和化學成分上，還沒有應用于酒曲的研究發(fā)表。大青葉主要含有生物堿、有機酸、苷類、甾醇等幾大類化合物，其揮發(fā)油成分主要有棕櫚酸、植酮、苯甲醇以及正二十九烷等烷烴類物質。
本研究以某酒廠酒曲中的一種添加植物——大青葉作為研究對象，探討添加中草藥對酒曲發(fā)酵過程酒曲理化參數(shù)及微生物活性的影響，為酒曲添加中草藥輔料的生產工藝提供理論依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
大青葉、餅丸（含釀酒酵母、產酯酵母、米根霉、毛霉、華根霉、乳酸菌、醋酸菌等微生物，常溫保藏）：廣東省九江酒廠有限公司；大米、黃豆等：市售；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、肉湯培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基、可溶性淀粉、葡萄糖、磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、硫酸鎂等（化學純）：國藥集團化學試劑有限公司；石油醚（色譜純）、乙醇（分析純）、己酸乙酯（分析純）、乙酸正戊酯（分析純）：上海泰坦科技股份有限公司。
1.2儀器與設備
7890A-5975C氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用分析儀：美國安捷倫公司；GC-2014C氣相色譜分析儀：日本島津公司ZDJ-4A自動電位滴定儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；BIOSCREEN C PRO全自動生長曲線分析儀；UV-2802SH紫外分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；5804R冷凍離心機：德國Eppendorf公司。
1.3方法
1.3.1酒曲培養(yǎng)基制備
參考酒廠酒曲制作工藝，以大米和黃豆為主料，兩者質量比為8∶2，分別按照1∶1加水、蒸煮30 m in、冷卻至35℃左右后混合，同時加入大青葉（粉碎度為1 cm左右）0、4.5%、9%和餅丸（1.5%），于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（35℃、相對濕度85%）培養(yǎng)6 d。發(fā)酵過程中需定時噴灑霧狀水以保持酒曲含水量。每隔2 d取樣分析。
1.3.2酒曲揮發(fā)性成分提取
將酒曲置于索氏提取管中。量取150 m L石油醚溶劑于250 m L圓底燒瓶內，置于85℃的恒溫水浴鍋中6 h，取樣，20 000 r/min離心15s，上清液（揮發(fā)油）置于樣瓶中，待測。
1.3.3測定方法
酒曲發(fā)酵樣品的糖化酶酶活、液化酶酶活、酯化力、含水量、酸度、密度的測定依照參考文獻。
發(fā)酵力測定采用排飽和碳酸鈉溶液收集CO2的方法。酒曲微生物測定：采用稀釋平板計數(shù)法。
揮發(fā)性成分（揮發(fā)油）分析方法：揮發(fā)油溶解于適量的石油醚，采用GC-MS進行分析。色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細柱管（30 m×0.25 mm，0.25μm）；升溫程序：50℃保留3 m in，4℃/m in升溫至230℃后，保持30 m in；進樣量為1μL；進樣口溫度為250℃；載氣為氦氣，流速2 m L/min。質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280℃；離子源溫度230℃；電子倍增器電壓1 858.8 V；掃描質量范圍35～350 m/z。在HP-5MS柱上使用一系列同源性C8-C25正烷烴對所有揮發(fā)成分進行標定分析，并通過美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）數(shù)據(jù)庫進一步確認。各組分相關濃度通過峰面積歸一化法計算求出各化合物的峰面積相對含量。