黃曲霉菌(Aspergillusflavus)，是腐生性的病原真菌。主要存在于玉米、棉花、花生以及許多干果和香料中。分離出來(lái)的大多黃曲霉菌都能產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物黃曲霉毒B1(AFB1)，它具有致癌性、致畸性、免疫抑制性，被認(rèn)定為自然界中危害性最大的生物毒素之一。黃曲霉毒素污染是極其棘手的食品安全問(wèn)題，黃曲霉毒素除對(duì)人畜的健康造成極大的危害外，也會(huì)對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)造成巨大的損失。因此如何有效地防治黃曲霉的污染具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
黃曲霉及其毒素污染防控一直是國(guó)際國(guó)內(nèi)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，黃曲霉毒素的防治方法主要有物理、化學(xué)、生物三種方法，但物理法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、去毒力不高，化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境有較大危害，而利用生物防治法來(lái)抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的技術(shù)處理?xiàng)l件比較溫和，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響較小，有利于環(huán)境保護(hù)及人體健康。因此，綠色防控技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前發(fā)展趨勢(shì)。黃曲霉及其毒素污染的生物防控是重要發(fā)展方向。
目前，黃曲霉毒素生物防治技術(shù)主要包括利用不產(chǎn)毒霉菌、拮抗微生物及其活性物質(zhì)、植物源活性物質(zhì)來(lái)抑制黃曲霉的產(chǎn)毒及生長(zhǎng)。研究乳酸菌對(duì)乳制品中黃曲霉毒素污染的生防作用，發(fā)現(xiàn)乳酸菌可以抑制黃曲霉生長(zhǎng)及黃曲霉毒素B1的產(chǎn)生，乳酸菌屬的許多菌株，包括丙酸桿菌屬Propionibacterium、乳球菌Lactococcus、雙歧桿菌Bifi-dobacterium和乳酸桿菌屬Lactobacillus等，均具有抑制黃曲霉生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的作用，但乳酸菌屬厭氧菌，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中難以保證厭氧的環(huán)境，從而限制了乳酸菌作為拮抗菌的實(shí)際應(yīng)用?？浊嗟劝l(fā)現(xiàn)一株海洋巨大芽孢桿菌可以抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，其在培養(yǎng)基中抑制率約為87%，并且此株巨大芽孢桿菌只可在受機(jī)械損傷的花生上抑制黃曲霉毒素的生物合成。
隨著人們對(duì)綠色環(huán)保理念的興起，生物防治黃曲霉菌侵染及其毒素產(chǎn)生成為一種主流研究方向。非脫羧勒克菌(Leclerciaadecarboxylata)wt16，是非脫羧勒克菌屬惟一的1個(gè)菌種，是腸桿菌科的一種具有動(dòng)力的革蘭陰性桿菌，通常來(lái)源于環(huán)境和動(dòng)物，于1962年被發(fā)現(xiàn)，生化特性與大腸埃希菌相似，其對(duì)黃曲霉的生防作用此前并未見(jiàn)報(bào)道，本研究首次將該非脫羧勒克菌wt16菌株進(jìn)行對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)及產(chǎn)毒的研究，并找出其有效作用成分，因此本文為日后研究分離鑒定非脫羧勒克菌wt16分泌的有效抑制黃曲霉毒素產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物提供了理論基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1材料與儀器
非脫羧勒克菌wt16分離自湖北黃陂，保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所;7個(gè)高產(chǎn)毒黃曲霉菌株73、271、393-2、54、pc157-2、pg11、pc400為本實(shí)驗(yàn)室前期分別從廣西北海、福建郡武、湖北黃陂、福建泉州、南昌進(jìn)賢、江西樟樹、湖北紅安分離獲得;大腸桿菌(E.coli)為本實(shí)驗(yàn)室分離保存;PDA培養(yǎng)基美國(guó)BD公司;LB固體培養(yǎng)基、沙氏液體培養(yǎng)基青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司;乙醇、吐溫80、丙三醇、磷酸鹽緩沖液(PBS)國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司。
恒溫培養(yǎng)振蕩器天津市歐諾儀器儀表有限公司;LEICA DMLS型光學(xué)顯微鏡德國(guó)LEICA公司;SU8010型高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡日本HITACHI公司;AUTESTER-E30型高壓滅菌鍋西班牙J.PSELECTA公司;WFO-400型干燥箱上海愛(ài)朗儀器有限公司;CPA224S型電子天平德國(guó)Sartorius公司。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1非脫羧勒克菌wt16種子液的制備LB固體平板上活化非脫羧勒克菌wt16菌株，37℃培養(yǎng)箱放置24 h，挑取單菌落于液體LB試管中，置于搖床中發(fā)酵，200 r/min，37℃，培養(yǎng)12 h。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中通過(guò)菌懸液濃度與吸光度值的回歸方程進(jìn)行計(jì)算，將后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需菌懸液濃度配制成107CFU/mL。
1.2.2黃曲霉菌孢子懸浮液的制備7種黃曲霉菌株(73、271、393-2、54、pc157-2、pg11、pc400)分別在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d后，用無(wú)菌水(含0.1%的吐溫80)將孢子從培養(yǎng)基上洗下，用血球板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。
1.2.3非脫羧勒克菌wt16對(duì)不同地區(qū)黃曲霉菌生長(zhǎng)的影響將非脫羧勒克菌wt16菌液(1×107CFU/mL)和7種不同地區(qū)的黃曲霉菌孢子懸液(5×105個(gè)/mL)同時(shí)接種于15 mL沙氏液體培養(yǎng)基中，以無(wú)菌培養(yǎng)液為空白、以大腸桿菌培養(yǎng)液(1×107CFU/mL)為對(duì)照替代非脫羧勒克菌wt16菌液，28℃培養(yǎng)5 d，分別測(cè)定菌絲干重。
1.2.4菌絲干重的測(cè)定以Whatman No.4濾紙過(guò)濾培養(yǎng)液，得到的菌絲于80℃烘干至恒重后，稱重。根據(jù)抑制率(%)=(對(duì)照組菌絲干重-處理組延菌絲干重)/對(duì)照組菌絲干重×100%，計(jì)算對(duì)黃曲霉菌絲生長(zhǎng)的抑制率。
1.2.5非脫羧勒克菌wt16對(duì)不同地區(qū)黃曲霉菌產(chǎn)毒的影響將非脫羧勒克菌wt16菌液(1×107CFU/mL)和7種不同地區(qū)黃曲霉孢子懸液(5×105個(gè)/mL)同時(shí)接種于15 mL沙氏液體培養(yǎng)基中，對(duì)照組分別以無(wú)菌培養(yǎng)液、大腸桿菌培養(yǎng)液(1×107CFU/mL)替代非脫羧勒克菌wt16菌液，28℃培養(yǎng)5 d，取1 mL培養(yǎng)液測(cè)定其黃曲霉毒素B1(AFB1)含量。抑制率(%)=(對(duì)照組毒素含量-處理組毒素含量)/對(duì)照組毒素含量×100。
1.2.6黃曲霉毒素的定量檢測(cè)將不同地區(qū)黃曲霉菌株在沙氏液體培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)7 d，產(chǎn)生孢子后用無(wú)菌吐溫水沖洗孢子制成孢子菌懸液，以終濃度為5×105個(gè)/mL在沙氏液體培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)5 d，雙層Whatman No.4濾紙過(guò)濾后用免疫親和柱-HPLC法檢測(cè)培養(yǎng)液中的黃曲霉毒素B1的含量。
取1 mL待測(cè)液過(guò)免疫親和柱，將黃曲霉毒素截留，用1 mL的甲醇洗脫，進(jìn)行高效液相分析，HPLC檢測(cè)條件為:色譜柱:Boston Boschrom ODS，4.6×150 Vmm，5 Vμm;流動(dòng)相:甲醇45%，水55%;光衍生流速:1 mL/min進(jìn)樣量:10μL;熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng):360 nm;發(fā)射波長(zhǎng):440 nm。
1.2.7非脫羧勒克菌wt16在花生粉上對(duì)黃曲霉73菌生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響將采集于湖北花生地，大小、成熟度均勻一致，無(wú)腐爛的花生顆粒研磨成花生粉，稱取1 g該花生粉于培養(yǎng)皿中，同時(shí)加入1 mL產(chǎn)毒力較居中的黃曲霉菌73孢子液(5×105個(gè)/mL)及1 mL非脫羧勒克菌wt16菌液(1×107CFU/mL)，以沙氏培養(yǎng)基代替非脫羧勒克菌wt16菌液為對(duì)照，在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d后加入15 mL 70%甲醇水，渦旋后放入搖床30 min。取3 mL上清加入8 mL超純水渦旋離心，取8 mL上清用免疫親和柱-HPLC法測(cè)定黃曲霉毒素B1的含量。抑制率(%)=(對(duì)照組毒素含量-處理組毒素含量)/對(duì)照組毒素含量×100。
1.2.8非脫羧勒克菌wt16在花生顆粒上對(duì)黃曲霉菌73生長(zhǎng)與產(chǎn)毒的影響取采集于湖北花生地，大小、成熟度均勻一致，無(wú)腐爛無(wú)機(jī)械損傷的花生顆?；ㄉ?0粒，將非脫羧勒克菌wt16菌液(1×107CFU/mL)包覆在花生表面，同時(shí)加入1 mL黃曲霉菌73孢子液(5×105個(gè)/mL)，以沙氏培養(yǎng)基代替wt16菌液為對(duì)照;將已接種后的花生粒在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d后，觀察其生長(zhǎng)情況，然后將花生粒研磨成花生粉，加入15 mL 70%甲醇水，渦旋后放入搖床30 min。取3 mL上清加入8 mL超純水渦旋離心，取8 mL上清用免疫親和柱-HPLC法測(cè)定黃曲霉毒素B1的含量。抑制率(%)=(對(duì)照組毒素含量-處理組毒素含量)/對(duì)照組毒素含量×100。
1.2.9非脫羧勒克菌wt16菌株對(duì)黃曲霉菌73株形態(tài)影響掃描電鏡分析將非脫羧勒克菌wt16菌液(1×107CFU/mL)和黃曲霉菌73孢子懸液(5×105個(gè)/mL)同時(shí)接種于15 mL沙氏液體培養(yǎng)基中，對(duì)照組分別以無(wú)菌培養(yǎng)液為對(duì)照，在28℃，200 r/min培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)好的黃曲霉菌絲經(jīng)3000 r/min離心8 min富集沉淀，取沉淀浸入磷酸鹽緩沖液PBS(0.1 mol/L、pH7.2、不含NaCl)中，漂洗細(xì)胞或組織數(shù)次，3000 r/min離心8 min去上清，加4℃預(yù)冷的戊二醛，在4℃固定4 h，吸出固定劑，用PBS浸洗3次。用系列梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%)分別脫水1次，再用100%乙醇徹底脫水2次，接下來(lái)加醋酸異戊酯2次后使其自然干燥。用真空噴鍍法噴鍍均勻，完成后在掃描電鏡下分別放大100倍、2000倍、5000倍、20000倍進(jìn)行觀察。
1.2.10非脫羧勒克菌wt16菌株不同發(fā)酵組分對(duì)黃曲霉73的影響為了探究非脫羧勒克菌wt16不同組分對(duì)黃曲霉菌73的影響，將wt16菌株進(jìn)行了3組處理，處理如下:處理Ⅰ:將非脫羧勒克菌wt16菌液以12000 r/min離心20 min后取其上清液用0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾制備無(wú)菌發(fā)酵上清液，在上清液中加入黃曲霉73孢子液培養(yǎng)5 d;處理Ⅱ:將非脫羧勒克菌wt16菌株發(fā)酵上清液以121℃高溫處理30 min后加入黃曲霉73孢子液培養(yǎng)5 d;處理Ⅲ:非脫羧勒克菌wt16菌株發(fā)酵液121℃高溫處理30 min滅活后的死菌體將用無(wú)菌水洗滌3遍后用沙氏液體培養(yǎng)基溶解，加入黃曲霉73孢子液后培養(yǎng)5 d;并進(jìn)行兩組對(duì)照:對(duì)照Ⅰ:以無(wú)菌培養(yǎng)基為對(duì)照，在沙氏液體培養(yǎng)基中加入黃曲霉73孢子液培養(yǎng)5 d;對(duì)照Ⅱ以大腸桿菌作為對(duì)照菌株將其(107CFU/mL)加入沙氏液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5 d后，加入黃曲霉73孢子液培養(yǎng)5 d。將以上處理測(cè)其菌絲干重及其黃曲霉73毒素含量。
1.2.11發(fā)酵時(shí)間對(duì)非脫羧勒克菌wt16菌株有效成分的影響將非脫羧勒克菌wt16菌株(107CFU/mL)加入到沙氏液體培養(yǎng)基中，在200 r/min，28℃搖床中分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7、8、9 d，以12000 r/min離心20 min，121℃高溫30 min制備無(wú)菌上清液，在其中加入黃曲霉73孢子液(5×105個(gè)/mL)，在200 r/min，28℃搖床中培養(yǎng)5 d后測(cè)其黃曲霉毒素含量。
1.2.12發(fā)酵溫度對(duì)非脫羧勒克菌wt16菌株有效成分的影響分別在10、15、20、25、30、35、40、45℃條件下，200 r/min搖床培養(yǎng)非脫羧勒克菌wt16菌液5 d，以12000 r/min離心20 min，121℃高溫處理30 min制備上清液，加入黃曲霉73孢子液(5×105個(gè)/mL)，在200 r/min，28℃搖床中培養(yǎng)5 d后測(cè)其黃曲霉73毒素含量。
1.3數(shù)據(jù)處理
所有實(shí)驗(yàn)內(nèi)設(shè)3個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)采用Excel分析處理。
實(shí)驗(yàn)證明：非脫羧勒克菌wt16可抑制黃曲霉生長(zhǎng)性及產(chǎn)毒（一）
實(shí)驗(yàn)證明：非脫羧勒克菌wt16可抑制黃曲霉生長(zhǎng)性及產(chǎn)毒（二）
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