討論
體外生態(tài)生理學(xué)研究腐敗和產(chǎn)毒真菌對(duì)更好理解不同環(huán)境參數(shù)下真菌行為以及開(kāi)發(fā)不同食品基質(zhì)中適當(dāng)控制策略至關(guān)重要?？颂m菲爾德的研究率先構(gòu)建響應(yīng)面圖分析關(guān)鍵環(huán)境因素如aw和溫度對(duì)許多腐敗和產(chǎn)毒真菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)和霉菌毒素產(chǎn)生的影響（Magan&Lacey，1984；Marin等人，1995；Cairns-Fuller等人，2005；Hope等人，2005；Medina&Magan，2010；Medina&Magan，2011）。當(dāng)研究包括三個(gè)或四個(gè)相互作用因素時(shí)，除非使用中心點(diǎn)統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)，否則復(fù)制、測(cè)量和所需消耗品使得進(jìn)行此類(lèi)實(shí)驗(yàn)logistics困難。因此，開(kāi)發(fā)一種快速方法，允許使用自動(dòng)監(jiān)測(cè)獲得絲狀生物準(zhǔn)確結(jié)果是一個(gè)有吸引力的選項(xiàng)。因此，檢查了使用分光光度比濁assay如Bioscreen進(jìn)行絲狀真菌此類(lèi)實(shí)驗(yàn)的潛力。
選擇YES培養(yǎng)基，因?yàn)檫@是常用于確定次級(jí)代謝產(chǎn)物（如霉菌毒素）生產(chǎn)的conducive培養(yǎng)基（Schmidt-Heydt等人，2008）。比較測(cè)試的不同瓊脂濃度顯示最佳結(jié)果使用含少量瓊脂的YES獲得，這提供了適合真菌孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)啟動(dòng)的半固體培養(yǎng)基。這種特定組成保留了接種在孔三維空間中的孢子。顯微鏡觀察確認(rèn)由于培養(yǎng)基組成和粘度，孢子不沉降在孔底。這導(dǎo)致更均勻萌發(fā)和三維菌絲網(wǎng)絡(luò)發(fā)展，以與菌絲生長(zhǎng)成比例的方式減少穿過(guò)孔的光線。這也給出更可重現(xiàn)實(shí)驗(yàn)。
孔間重現(xiàn)性，在同一板內(nèi)，和不同日期實(shí)驗(yàn)確認(rèn)系統(tǒng)可以優(yōu)化。不同接種物大小的效果也顯示孢子濃度10^5或10^6孢子/毫升給出最佳結(jié)果。有趣的是，使用培養(yǎng)基體積（最大500μl）對(duì)獲得的O.D.曲線影響很小。Bioscreen C微孔板格式的這些改進(jìn)允許延長(zhǎng)測(cè)量可以進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)間從48小時(shí)（Schnurer，1993；Meletiadis等人，2001a，2001b；Rossi-Rodrigues等人，2009）到72小時(shí)，然后進(jìn)一步延長(zhǎng)至7天以上。使用體積的獨(dú)立性也使該技術(shù)適用于多種應(yīng)用。這得到在不同aw和溫度條件下篩選PTS（18種濃度）可以在長(zhǎng)達(dá)7天周期內(nèi)進(jìn)行的支持。這也表明可能使用這些絲狀和產(chǎn)毒腐敗真菌獲得的數(shù)據(jù)集準(zhǔn)確建模生態(tài)因素和化學(xué)控制劑的效能。
為評(píng)估該技術(shù)潛力，我們使用黃曲霉作為模型系統(tǒng)，因?yàn)榭赡芊治龃渭?jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)以及抗真菌劑效能。選擇PTS因?yàn)樗惹拔幢缓Y選用于真菌控制。傳統(tǒng)生態(tài)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)和新技術(shù)并行進(jìn)行。使用傳統(tǒng)技術(shù)，數(shù)據(jù)收集過(guò)程在評(píng)估十種抗真菌處理濃度時(shí)需要1個(gè)月。相比之下，使用Bioscreen C這在僅7天內(nèi)實(shí)現(xiàn)。此外，該方法促進(jìn)了18種濃度篩選和每天72次自動(dòng)測(cè)量。
評(píng)估這種新提出方法確保其有用性研究不同環(huán)境條件下（不同溫度、水活度和抗真菌濃度）黃曲霉早期生長(zhǎng)階段。模型參數(shù)（P1和P2）計(jì)算能夠比較PTS的有效性，在不同環(huán)境條件下，無(wú)論黃曲霉生物量生產(chǎn)。這可能是該方法的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)。許多先前絲狀真菌研究使用菌絲生長(zhǎng)速率，這通常，尤其在環(huán)境脅迫下，可能不準(zhǔn)確反映給定時(shí)間存在的總真菌生物量。
這種新方法的MIC和NIC計(jì)算，使用LPM（Lambert&Pearson，2000）具有重要優(yōu)勢(shì)，它們完全獨(dú)立于實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)度。先前使用AUC，但不同曲線形狀和高O.D.讀數(shù)下曲線不規(guī)則行為產(chǎn)生高變異性差置信限。實(shí)驗(yàn)時(shí)間周期延長(zhǎng)通常導(dǎo)致AUC修改和增加變異性，阻止其應(yīng)用于長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)檢查生態(tài)生理因素對(duì)絲狀真菌萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響。在本研究中，使用TTD方法測(cè)量特定O.D.，已成功應(yīng)用于細(xì)菌研究（Bidlas&Lambert，2008）使能計(jì)算MIC和NIC，成功用于產(chǎn)毒真菌培養(yǎng)進(jìn)行這些計(jì)算。
使用傳統(tǒng)菌絲延伸速率方法獲得的LD50濃度值給出略高于本研究使用MIC50值方法獲得的抗真菌化合物濃度。這些差異可能由于不同計(jì)算方法。而LD50方法考慮外周菌絲長(zhǎng)度增加，MIC50值使用實(shí)際生物量作為閾值計(jì)算，并考慮劑量響應(yīng)（參數(shù)P2）。前者，更傳統(tǒng)方法，測(cè)量跨越菌落生長(zhǎng)邊緣領(lǐng)先菌絲在一維中進(jìn)行，不包括三維效果（總生物量）。本研究中使用的方法能夠檢測(cè)生物量差異，我們相信當(dāng)需要評(píng)估絲狀真菌中間脅迫條件時(shí)，MIC50值可能比LD50值更準(zhǔn)確。此外，LD50計(jì)算通過(guò)繪制和比較生長(zhǎng)速率與對(duì)照插值結(jié)果進(jìn)行。MIC、NIC和MIC50可以數(shù)學(xué)計(jì)算，從而提供準(zhǔn)確計(jì)算及其respective誤差和置信限。這種準(zhǔn)確定量評(píng)估MIC和NIC不僅對(duì)真菌生態(tài)生理學(xué)研究重要；它提供了有希望的新工具設(shè)計(jì)有效真菌保存方法考慮環(huán)境參數(shù)。因此，這種方法，使用基于數(shù)學(xué)分析的預(yù)測(cè)，可能成為食品保存中hurdle方法發(fā)展的重要組成部分（Gould，1995）。
該系統(tǒng)允許快速篩選對(duì)真菌孢子萌發(fā)效能短時(shí)間尺度（24-48小時(shí)）以及更長(zhǎng)周期，其中菌絲生長(zhǎng)和毒素生產(chǎn)效能可以量化（數(shù)據(jù)未顯示）。這表明Bioscreen C系統(tǒng)可以有效使用，不僅研究腐敗和病原細(xì)菌，而且用于絲狀真菌病原體的生態(tài)生理學(xué)和抗真菌篩選方法。
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