摘要
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)在工業(yè)發(fā)酵時面臨的噬菌體污染是行業(yè)難題。以飼料中常用的枯草芽孢桿菌K28為宿主分離得到一株裂解性噬菌體PJNB028，對其進行了生物學特性測定、全基因組注釋和系統(tǒng)進化分析和抗性菌篩選。PJNB028可在宿主菌平板形成圓形、透亮、邊緣清晰且有暈環(huán)的噬菌斑。PJNB028攜帶162 308 bp的線性雙鏈DNA，G+C含量為34%，含有237個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，屬于Caudoviricetes綱。最佳感染復數(shù)(MOI)為1，較為耐酸不耐堿(pH 3~11)，對紫外線較敏感;PJNB028的潛伏期為10 min，爆發(fā)期為70 min，爆發(fā)量為291 PFU/cell;在70~80℃高溫下處理1 h效價明顯降低，37℃作用8 h噬菌體對枯草芽孢桿菌繁殖體具有良好的抑菌效果。PJNB028能裂解莫哈韋芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等50%(n=20)的芽孢桿菌。通過噬菌體與宿主菌共培養(yǎng)篩選出3株抗性菌株，部分抗性菌株在發(fā)酵中表現(xiàn)出更高的α-淀粉酶活性及菌株效價。根據(jù)PJNB028生物學特性和基因組分析，可使用抗性菌株或結合熱堿液、高溫滅菌和紫外線消毒等防控噬菌體，為以后防治芽孢桿菌噬菌體污染提供了可靠的研究素材。
枯草芽孢桿菌是一種廣泛存于自然環(huán)境的好氧桿狀革蘭氏陽性菌，具有抑菌、耐酸、耐高溫和耐膽鹽等益生特性?？莶菅挎邨U菌在工業(yè)微生物領域具有較高的應用價值，是國際上公認的益生菌，只有單層細胞外膜，能將蛋白質分泌到培養(yǎng)基中，合成多種酶、核苷酸及抗生素等多種有機大分子物質，是多種酶類的理想原核表達宿主。枯草芽孢桿菌所需營養(yǎng)物質簡單，作為飼料添加劑能有效改善腸道菌群結構平衡。
噬菌體是感染細菌、真菌的病毒，分布十分廣泛，在治療臨床多重耐藥病原菌、控制加工食品致病菌的應用上具有巨大潛力。了解噬菌體的生物學特性，通過對其侵染和裂解機制的研究，篩選抗噬菌體菌株發(fā)酵生產(chǎn)枯草芽孢桿菌，是防止枯草芽孢桿菌在發(fā)酵過程中被噬菌體污染的必要環(huán)節(jié)。
早在1961年，研究者們就開發(fā)了一種直接分離枯草芽孢桿菌噬菌體的簡化程序。近年來，枯草芽孢桿菌噬菌體的多樣性逐漸被開發(fā)，已鑒定的最小裂解性噬菌體vB_BsuP-Goe1，基因組僅18 379 bp;裂解噬菌體φ29是研究病毒DNA包裝、復制和轉錄等過程的模型。通過觀察枯草芽孢桿菌感染噬菌體，研究者首次提供了噬菌體吸附和將基因組轉移到革蘭氏陽性菌結構變化的可視化，將枯草芽孢桿菌噬菌體建立為模型系統(tǒng)可能有助于更好地了解炭疽桿菌、蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等的噬菌體。
枯草芽孢桿菌噬菌體在食品工業(yè)中備受關注，一方面它可能會阻礙細菌發(fā)酵從而造成經(jīng)濟損失，如其在韓國大豆發(fā)酵中暴發(fā)的普遍性高。另一方面，噬菌體療法能靶向清除細菌生物膜，從而降低食源性疾病風險，這種生物控制策略在食品加工中是一項新的“綠色”技術。
本研究以枯草芽孢桿菌為宿主，分離得到了一株枯草芽孢桿菌噬菌體PJNB028，對其生物學特性和基因組特性進行了研究和分析，為枯草芽孢桿菌發(fā)酵污染防控提供研究素材。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1宿主菌與噬菌體來源
枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和莫哈韋芽孢桿菌等由實驗室分離保存，采用雙層平板法從土壤浸出液中分離噬菌體，純化后的噬菌體與60%甘油1∶1混合后置于-80℃長期保存。
1.1.2主要試劑和儀器
LB培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和酵母粉購自賽默飛世爾科技公司，氯化鈉(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司，瓊脂購自北京索萊寶科技有限公司;PCR儀購自賽默飛世爾科技公司;超速離心機購自湘儀離心機儀器有限公司;水浴鍋購自上海精宏實驗設備有限公司;動態(tài)吸收光酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司。
1.2方法
1.2.1噬菌體分離與純化
將10 g土壤和20 mL蒸餾水混合，12 000×g離心10 min，使用0.22μm無菌濾膜過濾上清液后，雙層瓊脂平板法檢測濾液中噬菌體。取100μL枯草芽孢桿菌菌液和500μL污水濾液在5 mL EP管混勻，加入50℃LB半固體(按體積加入0.6%瓊脂粉)培養(yǎng)基，快速顛倒混勻倒在事先準備好的LB瓊脂底板上，待上層半固體凝固后放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6~12 h，肉眼觀察噬菌斑形態(tài)及大小。
挑取單個噬菌斑放入10μL SM液吹打均勻，100μL菌液和4 mL 50℃LB半固體培養(yǎng)基混合倒入LB底板，待上層瓊脂凝固后點斑，置于37℃培養(yǎng)箱中待噬菌體長出后挑取單個噬菌斑擴培，重復5次以上至平板上存在大小形態(tài)比較一致的噬菌斑，挑取單個噬菌斑接入處于對數(shù)期的宿主菌菌液中，培養(yǎng)至菌液澄清后過濾，4℃保存。
1.2.2噬菌體基因組分析
使用OMEGA病毒DNA試劑盒提取噬菌體DNA，送至北京擎科生物科技有限公司進行全基因組測序。使用SPAdes軟件進行序列拼接。將拼接完成的全基因組序列提交至NCBI網(wǎng)站進行同源比對(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。使用在線平臺RAST(https://rast.nmpdr.org)進行功能預測，獲得噬菌體的全基因組注釋信息，將其氨基酸序列逐一使用blast在線blastp工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進一步對預測的基因進行注釋。使用SnapGene軟件繪制整個噬菌體基因組。使用tRNAscan-SE(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)搜索tRNA序列，用CARD數(shù)據(jù)庫(https://card.mcmaster.ca/analyze/blast)識別毒力基因和耐藥基因，使用MEGA5.0軟件繪制全基因組進化樹和末端酶大亞基進化樹。
1.2.3最佳感染復數(shù)測定
將培養(yǎng)至對數(shù)期的宿主菌按5%接種量加入10 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)4 h后取出進行效價測定，將保存的噬菌體原液測效價后梯度稀釋，按照感染復數(shù)(MOI)為10μL、1μL、0.1μL、0.01μL、0.001μL將100μL噬菌體液和100μL對數(shù)期枯草芽孢桿菌菌液進行混合，加入4.8 mL LB液體培養(yǎng)基放入細菌瓶培養(yǎng)2 h后，12 000×g離心10 min，上清液用0.22μm濾器過濾，使用雙層平板法測定不同MOI的噬菌體效價。通過計算得出最佳MOI。試驗重復3次。
1.2.4一步生長曲線測定
將噬菌體液與宿主菌菌液按最佳MOI混合，于溫箱37℃靜置10 min進行噬菌體吸附。10 000×g離心1 min，棄上清液并用LB液體培養(yǎng)基將沉淀重懸，加入37℃提前預熱的10 mL LB液體培養(yǎng)基充分混勻，置于37℃搖床中180 r/min培養(yǎng)。同時開始計時，在0 min和每隔10 min時取樣，12 000×g離心2 min，測定上清液中噬菌體效價，每組重復3次，繪制一步生長曲線。
1.2.5噬菌體溫度穩(wěn)定性測定
取噬菌體原液各1 mL置于不同溫度(37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)的水浴鍋中處理30 min、60 min后，通過雙層瓊脂平板法測定效價。試驗重復3次。
1.2.6噬菌體保存pH穩(wěn)定性測定
將SM緩沖液pH調整為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12并高壓滅菌，將100μL噬菌體液置于不同pH的SM緩沖液中，置于37℃搖床孵育1 h后，12 000×g離心10 min收集上清液，測定噬菌體效價，不同pH重復3次。
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