1.2方法
1.2.1分離菌株鑒定
(1)陰溝腸桿菌2025分離培養(yǎng)。福建養(yǎng)殖場(chǎng)污水經(jīng)過紗布過濾，接取濾液在APW培養(yǎng)基固體平板(按體積加入1.5%瓊脂粉)上三區(qū)畫線，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~16 h。挑取平板中菌落形態(tài)相同且數(shù)量最多的優(yōu)勢(shì)菌落加至APW液體培養(yǎng)基搖菌6 h，接取所得菌液在APW培養(yǎng)基固體平板上三區(qū)畫線，重復(fù)該步驟直到平板上只存在形態(tài)相同的菌落。將純化后的菌液于APW培養(yǎng)基(觀察高鹽環(huán)境生長情況)及LB培養(yǎng)基(觀察低鹽環(huán)境生長情況)固體平板(按體積加入1.5%瓊脂粉)上三區(qū)畫線，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，觀察不同培養(yǎng)基平板中菌落形態(tài)。
(2)陰溝腸桿菌2025 16S rRNA鑒定。利用16S rRNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的擴(kuò)增片段測(cè)序，測(cè)序工作由擎科生物科技公司完成。將所得結(jié)果在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比對(duì)，再利用MEGA軟件(https://www.megasoftware.net)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹確定其菌種。
(3)陰溝腸桿菌2025藥物敏感性試驗(yàn)。利用34種藥敏片鑒定陰溝腸桿菌2025對(duì)不同抗生素的耐藥性。將不同藥敏片貼在涂滿該菌的APW培養(yǎng)基固體平板上，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12~16 h，測(cè)量每種抗生素的抑菌圈直徑并與CLSI和EUCAST建立的耐藥判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)(抑菌圈直徑為0時(shí)，說明該抗生素對(duì)細(xì)菌無殺滅作用)。
1.2.2噬菌體分離純化與電鏡觀察
(1)陰溝腸桿菌2025噬菌體分離純化。參考Li等的方法，取揚(yáng)州某水產(chǎn)市場(chǎng)收集的污水50 mL于室溫環(huán)境下8 000×g離心10 min，經(jīng)0.22μmol/L濾網(wǎng)過濾后加入APW培養(yǎng)基配方(蛋白胨10 g/mL、氯化鈉30 g/mL)，充分混勻后加入對(duì)數(shù)期陰溝腸桿菌2025 50μL，在37℃、220 r/min培養(yǎng)箱中搖菌6 h。將培養(yǎng)液8 000×g離心10 min，離心后使用0.22μmol/L濾網(wǎng)過濾，采用雙層平板法檢測(cè)濾液中是否存在噬菌體。
雙層平板法:取200μL陰溝腸桿菌2025加至50℃半固體APW(按體積加入0.5%瓊脂粉)培養(yǎng)基中，快速顛倒混勻倒在固體APW培養(yǎng)基上，待上層瓊脂凝固后在雙層平板上不同位置滴加5μL處理過的水樣，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6~12 h，觀察是否有噬菌斑生成。
挑取單個(gè)噬菌斑后置入1.5 mL離心管搗碎，加入1 mL磷酸緩沖鹽(phosphate-buffered saline，PBS)緩沖液，震蕩15 s，室溫8 000×g離心10 min，取上清液用0.22μmol/L濾網(wǎng)過濾。取20μL濾液與2 mL菌液混合，于37℃、220 r/min培養(yǎng)箱搖菌5 h，取培養(yǎng)液室溫8 000×g離心10 min，使用0.22μmol/L濾網(wǎng)過濾。將濾液梯度稀釋10倍，每個(gè)梯度取100μL與100μL對(duì)數(shù)期陰溝腸桿菌2025菌液充分混合后加到50℃半固體APW(按體積加入0.5%瓊脂粉)培養(yǎng)基中，快速顛倒混勻倒在固體APW培養(yǎng)基上，待上層瓊脂凝固后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6~12 h，挑取單個(gè)噬菌斑擴(kuò)培，重復(fù)3~5次，直至在同一平板上只存在大小形態(tài)完全一致的噬菌斑即純化完成。
(2)噬菌體的電鏡觀察。將效價(jià)為1010 PFU/mL的噬菌體懸浮液在碳網(wǎng)格(200目)上孵育10 min，用2%磷鎢酸染色3 min，避光自然晾置30 min后，用透射電子顯微鏡HT 7800觀察。
1.2.3噬菌體ZX14生物學(xué)特性鑒定
(1)最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)測(cè)定。按照MOI為10、1、0.1、0.01、0.001的不同比例將噬菌體與對(duì)數(shù)期陰溝腸桿菌2025(1×109 CFU/mL)混合，培養(yǎng)2 h后測(cè)定不同MOI噬菌體效價(jià)。
(2)一步生長曲線繪制。參考黃橋欄等的方法，將噬菌體懸浮液(1×1010 PFU/mL)與對(duì)數(shù)期陰溝腸桿菌2025(1×109 CFU/mL)按MOI=1比例混合，37℃下靜止孵育15 min，4℃下8 000×g離心10 min，棄掉上清液以去除未吸附在宿主菌上的噬菌體顆粒。將沉淀重懸于1 mL APW液體培養(yǎng)基中，重復(fù)此步驟3~4次。取100μL重懸液至10 mL新鮮APW液體培養(yǎng)基中震蕩混勻，置于37℃、220 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔20 min取100μL培養(yǎng)液采用雙層平板法測(cè)定效價(jià)。根據(jù)“裂解量=裂解末期噬菌體效價(jià)/裂解初期宿主菌濃度”計(jì)算噬菌體ZX14的裂解量。
1.2.4噬菌體ZX14穩(wěn)定性鑒定
(1)噬菌體ZX14溫度耐受性測(cè)定。取噬菌體ZX14懸浮液(7×108 PFU/mL)各1 mL置于不同溫度(37℃、50℃、60℃、70℃、80℃)水浴鍋中處理20 min、40 min、60 min后測(cè)定效價(jià)。
(2)噬菌體ZX14 pH穩(wěn)定性測(cè)定。取4 g片狀氫氧化鈉溶于100 mL去離子水中，配制成1 mol/L氫氧化鈉溶液，再與1 mol/L鹽酸按不同比例配制成pH=2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0的緩沖液。將噬菌體ZX14(109 PFU/mL)分別與不同pH緩沖液按1∶9充分混合，于37℃靜置1 h后測(cè)其效價(jià)。
(3)氯仿敏感性測(cè)定。將噬菌體溶液與氯仿溶液按體積比為0.2、0.5、1、2、3、4混合，震蕩混勻15 s后靜置30 min，利用雙層平板法測(cè)量噬菌體效價(jià)。
1.2.5噬菌體ZX14宿主譜測(cè)定
測(cè)定菌株包括5種變形桿菌、5種發(fā)光桿菌、7種腸桿菌及4種不動(dòng)桿菌。采用雙層平板法檢測(cè)噬菌體ZX14對(duì)不同菌株是否具有裂解性，取200μL不同菌液加入到50℃半固體APW培養(yǎng)基中，快速顛倒混勻倒在固體APW培養(yǎng)基上，待上層瓊脂凝固后在雙層平板上不同位置滴加5μL噬菌體懸液，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6~12 h，觀察是否有噬菌斑生成。有則表明ZX14對(duì)該菌具有裂解性，標(biāo)記為(+);無則表明ZX14對(duì)其沒有裂解性，標(biāo)記為(-)。利用雙層平板法測(cè)定噬菌體ZX14對(duì)不同菌株的效價(jià)，再除以陰溝腸桿菌2025的效價(jià)以測(cè)定其成斑率(efficiency of plaquing，EOP)值，EOP≥0.5表明ZX14對(duì)該種細(xì)菌裂解效果較高，0.1≤EOP<0.5表明裂解效果中等，EOP<0.001表明噬菌體對(duì)該細(xì)菌無裂解效果，標(biāo)記為(/)。
1.2.6噬菌體體外殺菌活性實(shí)驗(yàn)
通過測(cè)量噬菌體對(duì)一定體積中細(xì)菌數(shù)量的影響來評(píng)估噬菌體在體外的殺菌作用。將噬菌體ZX14懸浮液與陰溝腸桿菌2025菌液(108 PFU/mL)按不同MOI(MOI=0.1、0.01和0.001)混合，并在37℃、220 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用微量分光光度計(jì)每30 min測(cè)定一次培養(yǎng)物OD600值。
1.2.7噬菌體ZX14基因組分析
利用病毒基因組提取試劑盒提取噬菌體ZX14基因組，樣品送至武漢臻閱生物科技有限公司，利用華大BGI平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序和全基因組序列拼接。噬菌體ZX14全基因組序列上傳至GenBank，序列號(hào)為PP236086。
全基因組序列通過tRNAscan-SE(2.0.9)進(jìn)行tRNA預(yù)測(cè)。在CARD數(shù)據(jù)庫(http://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/7106)與VFDB數(shù)據(jù)庫(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)進(jìn)行耐藥基因與致病菌毒力因子預(yù)測(cè)。使用RAST(https://rast.nmpdr.org/rast.cgi)對(duì)ORFs進(jìn)行注釋。使用蛋白質(zhì)比對(duì)工具(Basic Local Alignment Search Tool Protein，BLASTp)對(duì)所有ORFs在NCBI參考序列數(shù)據(jù)庫(Reference Sequence，RefSeq)中的病毒蛋白數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/#/)進(jìn)行檢索。基于BLASTp比較結(jié)果，使用OAT軟件(https://www.ezbiocloud.net/tools/orthoani)對(duì)基因組全序列進(jìn)行平均核苷酸相似度(average nucleotide identity，ANI)分析。將噬菌體末端酶大亞基序列在NCBI上進(jìn)行BLASTp檢索非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(Non-RedundantProtein Sequence Database，NR)，選取與其相似的前18個(gè)序列在MEGA軟件使用鄰接法(neighbor-joining method，NJ method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
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