兩個(gè)BirA同源物的表征
在益生菌乳酸球菌中，利用冗余基因破譯一種獨(dú)特的生物素，BPL被分為兩組：I組BPL缺乏N端DNA結(jié)合基序，而II組BPL（BirAs）具有N端DNA結(jié)合域。范式II組BPL是大腸桿菌BirA，此類酶也存在于古菌中，表明II組版本可能是BPL酶家族的祖先?；谧⑨?，乳酸乳球菌IL1403可能擁有兩種類型的BPL，此處稱為BirA1_LL（323個(gè)殘基，推定的II組BPL）和BirA2_LL（250個(gè)氨基酸，推定的I組BPL）。兩個(gè)BirA蛋白的多序列比對(duì)顯示，它們與大腸桿菌BirA相比，具有20.7%的同一性和34.6%的相似性（圖2）。
圖2.乳酸乳球菌BirA同源蛋白與大腸桿菌BirA的序列比對(duì)。多序列比對(duì)使用ClustalW2，軟件完成，最終輸出結(jié)果經(jīng)ESPript 2.2.程序處理。本研究采用大腸桿菌K-12 MG1655（登錄號(hào)AAC43075）的BirA_ec蛋白作為參照，乳酸乳球菌IL1403的兩個(gè)BirA同源蛋白作為參考序列。其中，紅色標(biāo)注的為BirA1_LL（登錄號(hào)NP_267937），藍(lán)色標(biāo)注的為BirA2_LL（登錄號(hào)NP_268060）。相同殘基以白色字母配紅色背景顯示，相似殘基以紅色字母配白色背景顯示，不同殘基以黑色字母顯示，空位用圓點(diǎn)表示。比對(duì)頂部展示了BirA的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)：其中，“α”代表螺旋結(jié)構(gòu)，“β”代表片層結(jié)構(gòu)，“T”代表轉(zhuǎn)角/卷曲結(jié)構(gòu)。標(biāo)注說(shuō)明：EC為大腸桿菌，LL為乳酸乳球菌。
為了測(cè)試兩個(gè)乳酸乳球菌IL1403 BirA蛋白的BPL活性，我們純化了六組氨酸標(biāo)簽蛋白至均質(zhì)。純化重組蛋白的SDS-PAGE圖譜表明BirA1約為40 kDa，而B(niǎo)irA2_LL估計(jì)約為30 kDa（圖3A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其身份，使用MALDI-TOF分析消化的多肽片段。MS結(jié)果支持兩個(gè)純化的重組蛋白是BirA1_LL（覆蓋率36.8%）和BirA2_LL（覆蓋率45.6%）（圖3B,C）。
圖3.乳酸乳球菌BirA1和BirA2蛋白的純化及質(zhì)譜鑒定。(A)兩種純化BirA蛋白（BirA1和BirA2）的12%SDS-PAGE電泳圖譜。首條泳道使用預(yù)染色蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(M)，圖左側(cè)標(biāo)注了各分子量單位（kDa）。通過(guò)液相色譜四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜驗(yàn)證兩種重組蛋白BirA1（圖B）和BirA2（圖C）的鑒定結(jié)果。與數(shù)據(jù)庫(kù)序列匹配的肽段片段以加粗下劃線形式標(biāo)注。BirA1的覆蓋率為36.8%，BirA2的覆蓋率為45.6%。
為了更好地可視化乳酸乳球菌兩種不同形式BPL的結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了結(jié)構(gòu)建模。與大腸桿菌BirA相似（圖4A），BirA1_LL也具有N端DNA結(jié)合基序和C端酶結(jié)構(gòu)域（圖4B,C），符合II組BPL的標(biāo)準(zhǔn)。BirA2_LL的結(jié)構(gòu)與嗜熱氫菌BirA（I組BPL成員）幾乎相同（圖4D-F），支持其分類為I組BPL。
圖4.乳酸乳桿菌兩種BirA同源蛋白的結(jié)構(gòu)解析。大腸桿菌BirA結(jié)構(gòu)（圖A）與乳酸乳桿菌BirA1（BirA1_LL）的建模結(jié)構(gòu)（圖B）具有高度結(jié)構(gòu)相似性。(C)BirA1_LL與BirA_EC的結(jié)構(gòu)疊加對(duì)比。BirA_EC結(jié)構(gòu)（PDB：1HXD）以黃色標(biāo)注，而與BirA_EC結(jié)構(gòu)同源性達(dá)28.6%的BirA1_LL結(jié)構(gòu)則以紫色呈現(xiàn)。(D)嗜熱棲熱菌BirA蛋白（BirA_AA）的整體結(jié)構(gòu)視圖，以及以BirA_AA為模板建模的BirA2_LL蛋白（圖E/F）結(jié)構(gòu)疊加對(duì)比。BirA_AA結(jié)構(gòu)（PDB：3EFS）以金色標(biāo)示，而以BirA_AA為模板、同源性達(dá)32.4%的BirA2_LL建模結(jié)構(gòu)則以紫色高亮顯示。標(biāo)注說(shuō)明：AA代表嗜熱棲熱菌；LL代表乳酸乳桿菌；N表示N端；C表示C端。
比較兩個(gè)乳酸乳球菌BirA蛋白的BPL活性
BPL活性使用充分研究的大腸桿菌模型和體外酶測(cè)定進(jìn)行測(cè)量。用于功能互補(bǔ)birA同源物的模型大腸桿菌菌株是birA1突變體BM4092，它缺乏合成生物素或高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)生物素的能力2?。正如預(yù)期，BM4092菌株無(wú)論帶有或不帶空載體pBAD24，在補(bǔ)充25 nM生物素的M9瓊脂平板上均不生長(zhǎng)（圖5A）。相反，阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)（甚至基礎(chǔ)表達(dá)）的birA1_LL和birA2_LL均支持BM4092在非允許生物素水平（25 nM）下生長(zhǎng)（圖5A）。
BM4092衍生物在液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線也給出了與瓊脂平板相似的結(jié)果（圖5B,C）。值得注意的是，birA1_LL的過(guò)表達(dá)似乎對(duì)大腸桿菌有輕微毒性，因?yàn)樘砑?.2%阿拉伯糖的BM4092菌株生長(zhǎng)與缺乏誘導(dǎo)劑阿拉伯糖的條件相比顯著抑制（圖5C）。總之，這些數(shù)據(jù)提供了體內(nèi)證據(jù)，表明乳酸乳球菌的兩個(gè)BirA直系同源物（BirA1_LL和BirA2_LL）具有BPL活性。
隨后，使用體外測(cè)定進(jìn)一步比較了BirA直系同源物的BPL功能，以評(píng)估生物素化活性。在此反應(yīng)中，包括了三個(gè)版本的BirA（BirA_ec、BirA1_LL和BirA2_LL），并使用BPLs靶向的AccB蛋白結(jié)構(gòu)域（指定為AccB87或BCCP87）作為底物（圖6A）。原則上，AccB87第122位保守賴氨酸（K122）應(yīng)在功能性BPL存在下被生物素化（圖1A）。使用薄層色譜（TLC）直接可視化BPLs將α-32P標(biāo)記的ATP和生物素轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物生物素酰-AMP（圖1A）（圖6B）。
TLC方法還提供了第二個(gè)連接酶部分反應(yīng)的間接證據(jù)，該反應(yīng)在引入受體蛋白AccB87時(shí)發(fā)生（即，將生物素從生物素酰-5'-AMP轉(zhuǎn)移到AccB87賴氨酸），導(dǎo)致生物素酰-5'-AMP中間體損失和AMP形成（圖1A和6B）。在AccB87存在下ATP消耗增加（尤其是BirA-ec）是由于在缺乏受體蛋白時(shí)，生物素酰-AMP仍緊密結(jié)合在連接酶活性位點(diǎn)內(nèi)，因此每個(gè)連接酶分子僅形成一個(gè)生物素酰-AMP分子（即生物素酰-AMP合成不是催化性的）。生物素轉(zhuǎn)移到受體蛋白允許催化和持續(xù)將ATP轉(zhuǎn)化為生物素酰-AMP。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了BPL活性。
我們的結(jié)果表明，乳酸乳球菌的兩種BirA蛋白都具有將生物素和[α-32P]-ATP轉(zhuǎn)化為典型生物素酰-5'-AMP中間體的能力（圖6B），并間接支持將生物素部分轉(zhuǎn)移到AccB87受體蛋白（圖6B）。BirA1_LL和BirA2_LL之間最顯著的區(qū)別是，在添加受體蛋白后，BirA2_LL測(cè)定中AMP與ATP的比率明顯高于BirA1_LL測(cè)定，并且BirA2_LL似乎形成更多的生物素酰-5'-AMP中間體（圖6B）。這表明BirA2_LL催化生物素附著的速度比BirA1_LL快。大腸桿菌BirA消耗了大部分α-32P標(biāo)記的ATP，而在乳酸乳球菌BirA測(cè)定中未觀察到ATP消耗的明顯增加（圖6B）。
這意味著在測(cè)試條件下，BirA_ec是三個(gè)BPL酶中最活躍的版本。使用MALDI-TOF直接測(cè)量由生物素化引起的AccB87質(zhì)量變化，如先前所述。在我們的測(cè)定中，AccB87的質(zhì)量計(jì)算為9335.5~9336.6（圖7A），生物素酰-AccB87的質(zhì)量確定為9562.3~9562.9（圖7B-D）?？傊?，數(shù)據(jù)說(shuō)明：1）乳酸乳球菌兩種版本的BirA（BirA1_LL和BirA2_LL）作為BPLs功能較弱；2）BirA2_LL相對(duì)于BirA1_LL更具催化活性。
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