摘要：為探討抗生素對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境微生物的影響，本研究通過采集洪湖養(yǎng)殖區(qū)地下水、湖水和魚塘水，分別分析其細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量及相應(yīng)耐藥（磺胺甲惡唑）微生物的分布規(guī)律，探討耐藥微生物數(shù)量及耐藥微生物占比與磺胺抗生素濃度之間的相關(guān)性，并采用Biolog法研究不同水體中微生物群落功能多樣性差異。結(jié)果表明，不同水體中微生物數(shù)量分布規(guī)律為：魚塘水>湖水>地下水，而湖水和魚塘水中的微生物數(shù)量受人為活動影響差異較大。三類水體均有不同程度耐藥微生物檢出，耐藥微生物數(shù)量分布規(guī)律為：魚塘水>湖水>地下水；耐藥微生物占比分布規(guī)律為：湖水>魚塘水>地下水。地下水中耐藥微生物數(shù)量與磺胺抗生素濃度無顯著相關(guān)性，而地表水中耐藥細(xì)菌、耐藥真菌數(shù)量及與磺胺吡啶和磺胺二甲基嘧啶濃度呈顯著正相關(guān)；地表水中耐藥細(xì)菌與耐藥放線菌占比均與磺胺砒啶呈顯著相關(guān)。Biolog多樣性分析結(jié)果表明，地表水微生物群落代謝活性和碳源利用性均高于地下水，說明洪湖湖水和魚塘水利用不同碳源的微生物物種較豐富。研究表明，不同環(huán)境水體中微生物的數(shù)量和耐藥性以及群落功能多樣性均有差異，該差異與人類活動和抗生素濃度有一定相關(guān)性。
近年來，抗生素在醫(yī)療業(yè)和養(yǎng)殖領(lǐng)域中得到廣泛使用，水環(huán)境中抗生素的存在已是普遍現(xiàn)象?；前奉惪股兀⊿ulfonamides，SAs）是一類具有廣譜抗菌效果的人工合成藥物，進(jìn)入體內(nèi)1~2 d后會以母體或代謝產(chǎn)物的形式排出，進(jìn)入到自然環(huán)境[1]。研究發(fā)現(xiàn)，磺胺類抗生素在水環(huán)境中有著較高的檢出率[2]。微生物是水環(huán)境中重要且活躍的組分[3-4]，其群落結(jié)構(gòu)和數(shù)量影響著水體的生態(tài)環(huán)境、營養(yǎng)水平及污染狀況[5]。每年大量的抗生素通過生活污水和養(yǎng)殖廢水進(jìn)入到水環(huán)境中，影響水環(huán)境中微生物的種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量，引發(fā)次級效應(yīng)，破壞生態(tài)平衡[6]。環(huán)境中長期殘留的抗生素還會導(dǎo)致耐藥微生物的產(chǎn)生[7]，耐藥微生物在環(huán)境中傳播擴(kuò)散，最終通過直接或間接（如食物鏈）途徑進(jìn)入人體，給人類健康帶來威脅[8]。隨著養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的大量使用，環(huán)境中耐藥微生物的分布已引起廣泛關(guān)注，有研究證明養(yǎng)殖區(qū)及周邊環(huán)境（土壤、水體）中均存在耐磺胺類抗生素的多種微生物[9-11]。因此，研究耐藥微生物數(shù)量與抗生素的濃度關(guān)系可為微生物的耐藥機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。
洪湖是湖北省最大的淡水湖，水生動植物資源十分豐富，兼具灌溉、漁業(yè)、水質(zhì)凈化、航運(yùn)等多種功能[12]。20世紀(jì)80年代洪湖開始圍網(wǎng)養(yǎng)殖，2002年到2004年達(dá)到高峰，養(yǎng)殖面積迅速擴(kuò)大，造成的污染遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過湖泊的自凈能力。養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展使得洪湖水質(zhì)明顯惡化[12]，從Ⅱ類水體降為Ⅳ類水體[13]。由于水產(chǎn)養(yǎng)殖投放的飼料中含有抗生素，未利用的抗生素在環(huán)境水體和底泥中不斷積累，經(jīng)過地表水和地下水的相互作用[14]，進(jìn)而污染地下水，引發(fā)一系列環(huán)境問題。所以，研究洪湖養(yǎng)殖區(qū)地表水和地下水中抗生素對環(huán)境微生物的影響具有重要意義。本文選取洪湖養(yǎng)殖區(qū)的地下水、湖水和魚塘水為研究對象，分別調(diào)查水體中細(xì)菌、真菌和放線菌對SAs耐藥菌數(shù)的分布規(guī)律，并分析耐藥微生物數(shù)量及占比與SAs的關(guān)系，同時采用Biolog法研究微生物總體活性與代謝功能的差異，以期通過微生物指標(biāo)了解洪湖養(yǎng)殖區(qū)水環(huán)境的污染特征，為抗生素的生態(tài)環(huán)境影響評價提供理論參考。
1、材料與方法
1.1、采樣點(diǎn)概況
本文以洪湖養(yǎng)殖區(qū)為研究對象，根據(jù)地下水、魚塘水和湖水三種不同環(huán)境水體，共設(shè)置26個采樣點(diǎn)，其中GW1~GW15為地下水，LW1~LW8為湖水，F(xiàn)W1~FW3為魚塘水。
1.2、水樣的采集與保存
水樣采集時間為2015年12月，通過地下水井閥（手壓井或機(jī)井）采集4 L地下水，利用水樣采集器采集1 L湖水和0.5 L魚塘水。將水樣置于無菌玻璃瓶中，微生物樣品經(jīng)真空抽濾于0.22μm濾膜上，并置于滅菌離心管中，密封放于冷凍箱，帶回實驗室放入-20℃冰箱保存待用。
1.3、水樣理化性質(zhì)及磺胺抗生素測定
利用便攜式水質(zhì)分析儀器（SX751型，上海三信）現(xiàn)場測水樣pH值、電導(dǎo)率、氧化還原電位（ORP）和溶解氧（DO），用采水器溫度計測水溫，水樣中TOC使用總有機(jī)碳（TOC）分析儀（Vario TOC，德國元素）測定。
水樣通過固相萃取小柱[oasis®HLB6cc（200mg）Extraction Cartridges，OASIS，Ireland]分離富集和純化，并采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（Access Max，Thermo Fisher）測定磺胺抗生素濃度[15]。
1.4、培養(yǎng)基制備及微生物計數(shù)
細(xì)菌培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）[16]、真菌培養(yǎng)基（改良馬丁培養(yǎng)基）[17]及放線菌培養(yǎng)基（高氏一號瓊脂培養(yǎng)基）[18]。
1.5、微生物計數(shù)
在無菌操作條件下，將膜用滅菌剪刀剪碎，加入25 mL無菌水，150 r·min-1條件下振蕩0.5 h，用移液槍反復(fù)沖洗使膜上細(xì)胞完全進(jìn)入溶液中，將膜取出，制成菌懸液，依次用無菌蒸餾水稀釋3個梯度，每個稀釋度設(shè)3個平行。取100μL稀釋樣品分別涂于不加和添加50 mg·L-1磺胺甲惡唑（Dr.Ehrenstorfer）的細(xì)菌、真菌、放線菌培養(yǎng)基平板上，于28℃恒溫保濕培養(yǎng)箱（HPX-250B5H-Ⅲ，上海新苗）中倒置培養(yǎng)。細(xì)菌、真菌、放線菌分別培養(yǎng)2、2、5 d后計數(shù)，實驗結(jié)果取3次試驗的平均值。
1.6、微生物群落功能多樣性分析
分別吸取1.5中微生物懸液150μL加入Biolog板各孔中，將接種的Biolog板放置于25℃恒溫保濕培養(yǎng)箱，每隔12 h用酶標(biāo)儀（Infinite®200 Pro Nano Quant，Tecan，瑞士）測定吸光度值（OD），本文采用培養(yǎng)120 h數(shù)據(jù)進(jìn)行地下水和地表水微生物群落多樣性評價。Biolog板中多底物酶聯(lián)（ELISA）反應(yīng)的單孔顏色平均吸光值（average well color development，AWCD）、微生物群落底物利用碳源數(shù)（S）、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、McIntosh指數(shù)及6大碳源利用根據(jù)文獻(xiàn)[19-21]來計算。
所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007進(jìn)行處理，采用SPSS 17.0進(jìn)行耐藥微生物數(shù)量及其占比與磺胺抗生素的相關(guān)性分析、樣品間的差異顯著性分析。
2、結(jié)果與分析
2.1、水樣理化性質(zhì)分析
從表1可以看出洪湖養(yǎng)殖區(qū)水體呈弱堿性，其中湖水pH最高可達(dá)8.75。主要原因是受洪湖居民生活污水的排放及冬季水生植物菹草的大量生長，水生植物白天因光合作用大量吸收水中CO2，導(dǎo)致湖水pH值升高[22]。
由于采樣時間為冬季，洪湖地表水溫度低于地下水水溫。地下水與地表水在ORP和DO等指標(biāo)上有明顯差異，地下水具有顯著的還原和缺氧環(huán)境。湖水和魚塘水的DO值最高分別可達(dá)12.01 mg·L-1和13.01 mg·L-1，這與王學(xué)雷等監(jiān)測的冬季洪湖水中DO最大值為13.32 mg·L-1相似[22]。洪湖水體中HCO3-濃度普遍較高，且地下水的HCO3-比湖水和魚塘水高出2~3倍，與電導(dǎo)率呈正相關(guān)性，這與含碳礦物溶解和土壤中CO2氣體的溶解等有關(guān)[23]，此結(jié)果與杜耘等研究結(jié)果相符[12]。
表1洪湖養(yǎng)殖區(qū)不同水體的理化指標(biāo)
Table 1 Physical-chemical properties of different water samples in aquaculture area of Honghu Lake
洪湖不同水體中TOC含量分布差異較大，地下水中TOC平均值為6.25 mg·L-1，其中GW3和GW15中TOC分別高達(dá)20.03 mg·L-1和14.29 mg·L-1。魚塘水中TOC含量遠(yuǎn)高于湖水，平均值是湖水中TOC的1.62倍，說明魚塘養(yǎng)殖增加了有機(jī)質(zhì)含量。
2.2、微生物和耐藥微生物數(shù)量及其耐藥占比分布
微生物和耐藥微生物數(shù)量及其耐藥占比分布見圖2。研究表明，影響水體中微生物生長的環(huán)境因素較多，如pH、DO、溫度、TOC等對微生物生長均有重要影響[24]。由表1可以看出，地下水與地表水的電導(dǎo)率、氧化還原電位、溶解氧及TOC相差較大，而魚塘水與湖水的TOC也具有明顯差異。這些理化性質(zhì)很可能是影響三種水體中微生物數(shù)量差別的重要因素。
圖1研究區(qū)域及采樣點(diǎn)布設(shè)
Figure 1 Map of sampling sites in Honghu Lake
圖2洪湖養(yǎng)殖區(qū)水環(huán)境中微生物和耐藥微生物數(shù)量及其耐藥占比的分布
Figure 2 Numbers of microorganisms and antibiotic resistant microorganisms and proportion in aquaculture environment of Honghu Lake
洪湖地下水中有不同程度的微生物分布，細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量范圍分別為（0.01~1.69）×103、（0.01~1.26）×103、（0.01~0.26）×103 cfu·mL-1。樣品GW1、GW5、GW8、GW13中真菌數(shù)量相對其他樣品較高，最高可達(dá)1.26×103 cfu·mL-1。地下水中放線菌主要來自土壤和空氣，20%樣品中放線菌數(shù)量高于102 cfu·mL-1。近年來，由于地表水質(zhì)的惡化，受地表水補(bǔ)給的影響，地下水污染已日趨嚴(yán)重。由于農(nóng)村打井條件簡陋，加上缺乏有效的環(huán)境治理措施，農(nóng)村的地下水源已受到不同程度的污染[25]。洪湖水環(huán)境中微生物的數(shù)量分布表明該研究區(qū)已受到一定程度的污染，存在飲水安全問題，這與我國其他地區(qū)出現(xiàn)的污染狀況類似[26]。
地下水中耐藥細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量范圍分別為（0~0.2）×103、（0~0.5）×103、（0~0.02）×103 cfu·mL-1，檢出樣品數(shù)分別為11、8、3個，檢出率分別為73.33%、53.33%和20%，說明地下水中有一定比例的耐藥菌存在，其中4個樣品中耐藥細(xì)菌數(shù)在102 cfu·mL-1以上，最高達(dá)2×102 cfu·mL-1，耐藥真菌數(shù)和放線菌數(shù)最高分別可達(dá)5×102 cfu·mL-1和24 cfu·mL-1。地下水中耐藥細(xì)菌的占比較低，絕大多數(shù)占比都在10%左右，只有GW7、GW10和GW12的耐藥細(xì)菌占比較高，分別達(dá)到了50%、94%和78%。其中GW10緊挨魚塘，受魚類養(yǎng)殖影響較大。而GW7和GW12均是居民居住聚集地區(qū)，地下水受到人為影響大。地下水中耐藥真菌占比較高，接近一半的采樣點(diǎn)的耐藥真菌占比都高于45%，最高可達(dá)88%。而放線菌的耐藥占比則普遍不高。已有研究表明，地表水中的抗性菌株可經(jīng)多種途徑進(jìn)入到地下水中[27]。
地表水中細(xì)菌、真菌、放線菌的數(shù)量總體高于地下水，而魚塘水中數(shù)量又高于洪湖湖水（除LW4外），不同樣品間微生物數(shù)量差異顯著。除LW6、LW7、LW8樣品中微生物數(shù)量較少外，其他均較高，湖水微生物數(shù)量與居民生活、漁業(yè)和畜禽養(yǎng)殖等活動密切相關(guān)。如LW3、LW4湖水中有小面積的圍欄養(yǎng)魚；LW2、LW5湖水位于村民住宅旁；LW1湖水周圍正在修路，說明人類活動對湖水造成一定程度的污染。而LW6、LW7、LW8是離居民地較遠(yuǎn)湖心水域，人為影響較小。人類活動排放的生活污水和養(yǎng)殖廢水能增加水環(huán)境中有機(jī)質(zhì)的含量，且污染水體中的微生物數(shù)量與有機(jī)物含量有顯著的相關(guān)性[28]。從表1中可看出湖水和魚塘水中TOC的含量均高于地下水，魚塘水體的TOC達(dá)到了地下水的2.3倍。因此，受人類活動影響的地表水微生物數(shù)量較高。特別是養(yǎng)殖池塘屬于相對封閉型，在養(yǎng)殖過程中池塘水體基本上不與外界發(fā)生水體交換，因而池塘中積累了豐富的營養(yǎng)鹽[29]，使微生物生長迅速，造成池塘中微生物數(shù)量增加。
湖水中耐藥細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量范圍分別為（0.018~3.75）×103、（0.05~1.45）×103、（0~0.079）×103 cfu·mL-1，其中LW4耐藥細(xì)菌和真菌數(shù)量最高，遠(yuǎn)離居民區(qū)的LW6、LW7、LW8中耐藥菌數(shù)量相對較少，說明耐藥菌數(shù)量與人類活動有一定關(guān)聯(lián)，這與北江流域中的耐藥細(xì)菌分布規(guī)律相似[30]。另外，8個湖水采樣點(diǎn)中，只有LW7的耐藥細(xì)菌占比是19%，其他7個采樣點(diǎn)占比均在30%~70%間，其中LW4的耐藥細(xì)菌占比最高，為62%。說明湖水中的耐藥細(xì)菌占比很高。洪湖魚塘水中耐藥細(xì)菌和真菌遠(yuǎn)高于湖水，由于人工養(yǎng)魚過程中投入抗生素，未被吸收的抗生素通過糞便排入水體，使得耐藥菌數(shù)量增加。3個魚塘水中，只有FW2的耐藥細(xì)菌占比為11%，其他兩個采樣點(diǎn)的耐藥細(xì)菌占比分別為57%和42%。魚塘作為抗生素耐藥菌和耐藥基因的源，其污染狀況備受關(guān)注，不同地區(qū)的養(yǎng)殖場水體中檢出不同程度耐藥的菌株[31-34]。
2.3、耐藥微生物數(shù)量及耐藥占比與SAs濃度相關(guān)性分析
環(huán)境抗生素污染促進(jìn)耐藥微生物生存和繁衍，進(jìn)而對生態(tài)環(huán)境造成潛在危害[35-36]，因此分析環(huán)境中抗生素濃度和耐藥菌的關(guān)系有助于了解耐藥菌在環(huán)境的產(chǎn)生及傳播規(guī)律。本文測得地下水中磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹惡啉和磺胺甲惡唑濃度平均值分別為0.15、3.07、0.72、4.41、7.60 ng·L-1。經(jīng)SPSS相關(guān)性分析得出，地下水中耐藥微生物數(shù)量和SAs濃度的相關(guān)性并不顯著。據(jù)報道，不同類型抗生素在水體中的存在將對微生物耐藥性產(chǎn)生影響[37]，即不同抗生素對細(xì)菌耐藥性具有共選擇作用，導(dǎo)致單一類型抗生素與相應(yīng)耐藥菌的相關(guān)性減弱[38]。
湖水和魚塘水均屬于受人為活動影響較大的地表水，本文將地表水中耐藥微生物及其占比與磺胺抗生素進(jìn)行相關(guān)性分析（表2），地表水（湖水和魚塘水）中五種磺胺抗生素濃度分別為0.43、24.75、5.44、138.9、288.39 ng·L-1，SPSS相關(guān)性分析表明耐藥細(xì)菌數(shù)與耐藥真菌數(shù)均與磺胺吡啶和磺胺二甲嘧啶的濃度具有一定程度的相關(guān)性，同時耐藥細(xì)菌占比也與磺胺吡啶的濃度具有相關(guān)性。耐藥放線菌和SAs相關(guān)性不顯著，但是其占比卻和磺胺吡啶濃度呈負(fù)相關(guān)。有研究表明，北京溫榆河中四環(huán)素類、氟喹諾酮類耐藥大腸桿菌與相應(yīng)抗生素濃度也存在相關(guān)關(guān)系，推測抗生素是其抗藥菌發(fā)生的決定因素[39]。
表2耐藥微生物數(shù)量及耐藥占比與地表水中磺胺抗生素濃度相關(guān)性分析
Table 2 Correlation analysis of resistant microorganisms and proportion with sulfonamide concentration in surface water
2.4、微生物群落功能多樣性
微生物群落平均活性AWCD（Average well color development）是用顏色平均變化率來評判微生物群落的碳源利用能力，指示微生物的代謝活性[40]。微生物群落AWCD隨培養(yǎng)時間的變化趨勢如圖3所示，由于地下水微生物較少，整個培養(yǎng)過程中微生物活性較低，受污染的地下水GW7和未受污染的地下水GW14在96 h前AWCD變化基本一致，在96 h后GW7活性略高于GW14，整個培養(yǎng)過程兩個樣品中AWCD差異不大。地表水LW4和FW3的微生物生長在0~40 h變化較小，40 h后開始急劇上升，說明碳源的利用主要在40 h后，在96 h基本達(dá)到平穩(wěn)，LW4在平穩(wěn)期的AWCD值遠(yuǎn)大于FW3，說明LW4中微生物對碳源利用能力和代謝活性更強(qiáng)，這與兩個樣品中微生物數(shù)量和整體活性有關(guān)。
圖3不同水樣中AWCD隨培養(yǎng)時間的變化
Figure 3 The change of AWCD in different water samples with incubation time
微生物群落代謝功能多樣性評價中底物利用碳源數(shù)是表征微生物群落對底物利用的廣泛性和差異性的指標(biāo)，Shannon指數(shù)是研究群落物種數(shù)量及其個體數(shù)量和分布均勻程度的綜合指標(biāo)，受群落物種豐富度影響較大；McIntosh指數(shù)是群落物種均一性的度量指標(biāo)；Simpson指數(shù)是反映群落中最常見物種的衡量指標(biāo)。
由表3知，GW7和GW14地下水樣品中微生物群落底物利用碳源數(shù)、Shannon、McIntosh和Simpson指數(shù)差異不大，說明微生物群落對碳源利用性、豐富度、均一性及物種數(shù)相似。地下水與地表水相比，微生物數(shù)量少，活性低，所以對碳源的利用數(shù)和利用能力都很低。地下水的理化性質(zhì)和地表水有顯著差異，如地下水ORP值很低，水體還原性越強(qiáng)，微生物的多樣性越低[41]。另外，地下水中微生物群落均一性很低，且不存在優(yōu)勢菌種。
表3不同水體樣品中微生物群落代謝功能多樣性評價
Table 3 Assessment of functional diversity metabolized by microbial community in different water samples
FW3與LW4相比，魚塘水相對封閉，營養(yǎng)物質(zhì)大量累積，某些有機(jī)物相對容易降解，水體中微生物對這些碳源利用有選擇偏好[42]，因此，魚塘水中微生物的碳源利用數(shù)更少。同時，由于長期投加養(yǎng)殖飼料，魚塘水環(huán)境中抗生素含量較高。抗生素會使得非耐藥菌生長受限，耐藥優(yōu)勢菌菌群生長良好，嚴(yán)重破壞水體生態(tài)平衡，降低微生物群落的多樣性[43]，所以魚塘水微生物豐富度要低于湖水。表3結(jié)果顯示，湖水中存在著某類優(yōu)勢菌種，且微生物的均勻性更高。
由圖4可知，地下水GW7和GW14對6大類碳源利用情況相似，對碳水化合物類利用程度最高，湖水LW4微生物除對胺類利用度較低外，對其他5種碳源均有較高利用。魚塘水FW3對碳水化合物類、聚合物類、復(fù)合類有較高利用，說明洪湖湖水和魚塘水整體利用不同碳源的微生物物種較豐富。這將為我們了解洪湖水體微生物營養(yǎng)需求提供數(shù)據(jù)支持，并為以后養(yǎng)殖水體異養(yǎng)微生物定向強(qiáng)化提供可靠依據(jù)[44]。
圖4不同水體中微生物對6大碳源利用
Figure 4 Situation utilized for six types of carbon sources by microbial community in different water samples
3、結(jié)論
（1）洪湖地下水、湖水、魚塘水中微生物數(shù)量（細(xì)菌、真菌、放線菌）分布差異較大。湖水中微生物數(shù)量受人為活動影響較大，池塘水由于養(yǎng)殖活動，其微生物數(shù)量整體高于湖水。
（2）不同水體中耐藥細(xì)菌、真菌、放線菌均有不同程度檢出。地下水中耐藥微生物數(shù)量及耐藥占比與磺胺抗生素?zé)o顯著相關(guān)性。湖水和魚塘水中耐藥微生物數(shù)量較高，與磺胺吡啶和磺胺二甲基嘧啶呈顯著正相關(guān)，同時耐藥細(xì)菌占比和耐藥放線菌占比也與磺胺吡啶的濃度具有相關(guān)性。
（3）地下水中微生物群落多樣性低于地表水，且對碳源的利用數(shù)更少；湖水微生物相比于魚塘水微生物，其群落更為豐富，均一性更高，且存在某種優(yōu)勢菌種。
（4）洪湖受污染與未受污染的地下水中微生物群落代謝的平均活性、對碳源利用性、豐富度、均一性及物種數(shù)相似，對碳水化合物類碳源利用程度較高；湖水和魚塘水中整體利用不同碳源的微生物較豐富，對碳水化合物類、聚合物類、復(fù)合類碳源均有較高利用。
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