NicA2和Pnao的表征
為了驗(yàn)證該新型基因的預(yù)測(cè)，從S16菌株克隆了nicA2并在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中表達(dá)（文本S1）。IPTG誘導(dǎo)后，在大腸桿菌裂解物中發(fā)現(xiàn)了大約50 kDa的大量蛋白質(zhì)，而在未誘導(dǎo)細(xì)胞或僅含有載體的細(xì)胞中觀察不到這樣的條帶（圖6A）。含有pET28a-nicA2質(zhì)粒的靜息細(xì)胞用于轉(zhuǎn)化尼古丁，并且它們可以降解尼古丁，如UV掃描分析所示；因此證實(shí)nicA2基因產(chǎn)物具有預(yù)期的功能（圖6B）。通過(guò)TLC和GC-MS分析鑒定了中間體N-甲基米斯明(P)，并且我們觀察到與先前報(bào)道相同的結(jié)果（圖6C和圖6D）[11]。
用Ni-NTA親和柱純化了His6標(biāo)記的NicA2，并通過(guò)SDS-PAGE確認(rèn)了酶的純度，在接近50 kDa處觀察到單一條帶（圖S5A）。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持FAD參與NicA2的功能。在382和452 nm處的紫外可見最大吸收峰，在410 nm處有最小吸收峰，是黃素蛋白的特征（圖S5B）。分別敲除了nicA2和pnao基因，并進(jìn)行了相關(guān)的細(xì)胞生長(zhǎng)和靜息細(xì)胞反應(yīng)（文本S1）。nicA2和pnao基因缺失突變體不能在尼古丁培養(yǎng)基平板和液體培養(yǎng)物中生長(zhǎng)（圖7A和圖7C）。
然而，缺失突變體S16dpnao在含有1 g l-1尼古丁的LB培養(yǎng)基中可以很好地降解尼古丁，其速率與野生型菌株S16相當(dāng)（圖7D）。與S16菌株相反，nicA2基因缺失突變體的靜息細(xì)胞不能降解尼古?。▓D7E）。pnao基因缺失突變體可以在含有1 gl-1尼古丁的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并將其顏色變?yōu)樯铧S色，而nicA2缺失突變體的培養(yǎng)基顏色沒有變化。此外，pnao基因缺失突變體的靜息細(xì)胞降解尼古丁，但它不能進(jìn)一步降解N-甲基米斯明，并且不能利用尼古丁作為唯一碳源和氮源（圖7A、7C和7E）。上述事實(shí)表明酶NicA2和Pnao對(duì)于該菌株的尼古丁降解至關(guān)重要。
材料與方法
化學(xué)品
L-(-)-尼古?。兌?9%）購(gòu)自Fluka Chemie GmbH（Buchs Corp., Switzerland）。測(cè)序級(jí)胰蛋白酶來(lái)自Promega（Madison, Sweden）。SP（98%）來(lái)自Toronto（Canada）。所有其他試劑均為分析級(jí)并可商業(yè)獲得。
細(xì)菌菌株、培養(yǎng)條件和測(cè)定
惡臭假單胞菌S16在含有1 g l-1尼古丁作為碳源和氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如前所述[9]。該細(xì)菌也在含有1 g l-1甘油、1 g l-1 (NH4)2SO4和礦物鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，初始pH為7.0，含有13.3 g l-1 K2HPO4·3H2O、4 g l-1 KH2PO4、0.2 g l-1 MgSO4·7H2O和0.5 mg微量元素溶液。微量元素溶液（每升0.1 M HCl）包含以下材料和數(shù)量：0.05 g CaCl2·2H2O、0.05 g CuCl2·2H2O、0.008 g MnSO4·H2O、0.004 g FeSO4·7H2O、0.1 g ZnSO4、0.1 g Na2MoO4·2H2O和0.05 g Na2WO4·2H2O。尼古丁、SP和HSP的定量數(shù)據(jù)通過(guò)高效液相色譜（HPLC）分析獲得，根據(jù)先前的報(bào)告[11,12]。
用于HPLC-MS/MS分析的蛋白質(zhì)組制備
將在尼古丁或甘油作為碳源生長(zhǎng)的惡臭假單胞菌S16細(xì)胞分別懸浮在PBS緩沖液中。用PBS緩沖液洗滌后，將細(xì)胞重懸在緩沖液（8 M尿素，0.05% SDS，10 mM DTT，10 mM Tris，pH 8.0）中，并用液氮研磨裂解。在12,000 g（10分鐘，4°C）離心后，將上清液與丙酮（預(yù)冷）按體積比1:4混合。在-20°C過(guò)夜孵育后，將混合物在12,000 g（10分鐘，4°C）離心。用預(yù)冷丙酮洗滌沉淀三次，并重懸在含有6 M Gu-HCl，100 mM Tris，pH 8.3的緩沖液中。使用改良的Bradford方案測(cè)定蛋白質(zhì)含量。將酶溶液（100μg）懸浮在含有10 mM DTT的緩沖液中，在56°C下放置0.5小時(shí)，然后在25°C下加入50 mM IAA放置40分鐘。經(jīng)過(guò)3 K超濾膜超濾并用100 mM NH4HCO3沖洗膜后，將溶液的pH調(diào)節(jié)至8.0-8.5。將40μg測(cè)序級(jí)修飾胰蛋白酶加入提取物中，并在37°C下溫和旋轉(zhuǎn)（蛋白質(zhì)：胰蛋白酶比例=50:1）進(jìn)行消化過(guò)夜。
2D-LC/MS和蛋白質(zhì)鑒定
為了從細(xì)胞混合物中鑒定蛋白質(zhì)，使用了蛋白質(zhì)組學(xué)中的多維液相色譜，使用1100 LC系統(tǒng)。第一維開始是用真實(shí)的連續(xù)線性鹽梯度（0-130分鐘，2%-35%；130-135分鐘，35%-90%；135-140分鐘，90%；140-141分鐘，90%-2%；141-180分鐘，2%）從硅膠強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱（0.075 mm x 5 cm）和C18柱（0.075 mm x 10 cm）（Column Technology Inc.）洗脫肽段。色譜條件：緩沖液A：H2O；緩沖液B：乙腈。納噴霧柱直接連接到LTQ Classic離子阱質(zhì)譜儀（Thermo Fisher）的孔口。納噴霧電離通過(guò)3.5 kV的噴霧電壓和200°C的加熱毛細(xì)管溫度實(shí)現(xiàn)。m/z范圍從400到1800。
蛋白質(zhì)組生物信息學(xué)
使用蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)軟件1.2（ThermoFisher, CA, USA）對(duì)MS或MS/MS譜進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。在整個(gè)色譜運(yùn)行過(guò)程中收集質(zhì)譜圖。通過(guò)Bioworks分析質(zhì)譜圖。自動(dòng)識(shí)別和組織高得分肽段匹配。使用來(lái)自注釋的惡臭假單胞菌S16基因組的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含總蛋白質(zhì)條目。假定電荷狀態(tài)Z=1且XCorr得分>2.2，或電荷狀態(tài)Z=3且XCorr得分>3.75的肽段匹配被自動(dòng)接受為有效。
RNA提取和實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）
從基本培養(yǎng)基平板上隨機(jī)挑取惡臭假單胞菌S16的單個(gè)菌落，并將新鮮過(guò)夜培養(yǎng)物的1:100稀釋液接種到三個(gè)250 ml錐形瓶中的50 ml基本培養(yǎng)基（對(duì)照）和添加了1 g l-1尼古丁的基本培養(yǎng)基（誘導(dǎo)）中。分批培養(yǎng)在30°C下以搖動(dòng)（200 rpm）培養(yǎng)至中期指數(shù)期（OD600 1.4）。通過(guò)14,000 g離心2分鐘收獲中期指數(shù)期細(xì)胞，并將沉淀在-70°C儲(chǔ)存過(guò)夜（16小時(shí)）。使用RNAprep pure細(xì)胞/細(xì)菌試劑盒（Tiangen）從約1x10^9個(gè)惡臭假單胞菌S16細(xì)胞中提取總RNA，并通過(guò)NanoVue（GE Healthcare）定量。使用隨機(jī)六聚體引物和SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen）將0.8 mg經(jīng)DNase（Fermentas）處理的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將cDNA稀釋1:10，并作為qPCR分析的模板，使用CFX96實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad）與SYBR Green RealMasterMix（Tiangen）和qPCR引物（表S4）。使用熔解曲線和瓊脂糖凝膠分析確認(rèn)PCR產(chǎn)物的特異性。用惡臭假單胞菌S16基因組DNA的十倍稀釋液構(gòu)建每個(gè)引物對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)通常使用惡臭假單胞菌S16的對(duì)照和尼古丁誘導(dǎo)培養(yǎng)物進(jìn)行三次重復(fù)，并將每個(gè)靶基因的閾值周期（CT）值歸一化到參考基因16S rRNA基因。使用2^–ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平，其中ΔΔCT = (CT,靶標(biāo) - CT,16S)誘導(dǎo) - (CT,靶標(biāo) - CT,16S)對(duì)照[30]。
構(gòu)建spmABC基因破壞的突變體惡臭假單胞菌S16dspm
通過(guò)PCR從惡臭假單胞菌S16總DNA中擴(kuò)增攜帶5'和3'截短的spmA片段，并克隆到pK18mob的多克隆位點(diǎn)中，pK18mob是一種不能在假單胞菌中復(fù)制的可移動(dòng)質(zhì)粒。PCR引物序列如下：spmA-Sall, CCACGTCGACCAAGTTAACTGGTTATGCGAC 和 spmA-EcoRI, CCACGAATTCAGTCCTTGGCCGAAACTTTGC。通過(guò)雙親濾膜接合[31]將重組質(zhì)粒從廣宿主范圍動(dòng)員菌株大腸桿菌S17-1轉(zhuǎn)移到惡臭假單胞菌S16。供體和受體分別在37°C和30°C的LB肉湯中培養(yǎng)至OD600mm 0.6。將10^9個(gè)供體細(xì)胞和2x10^9個(gè)受體細(xì)胞用0.85% NaCl洗滌三次，混合并涂布在置于LB瓊脂上的0.45-μm濾膜上。平板在37°C正面朝上培養(yǎng)5小時(shí)，然后在30°C培養(yǎng)12小時(shí)。然后將細(xì)胞重懸在0.5 ml 0.85% NaCl中，并以不同稀釋度鋪在含有100 mg l-1卡那霉素的M9平板上，并在30°C培養(yǎng)。通過(guò)使用引物對(duì)spmA-Sall和pK18mob-269, GCTTCCCAACCTTACCAGAG進(jìn)行PCR分析測(cè)試Kan抗性轉(zhuǎn)接合子。
構(gòu)建含有互補(bǔ)spmABC基因的質(zhì)粒pME6032-spm100
使用表S5中的引物從惡臭假單胞菌S16的總DNA中擴(kuò)增包含spmABC基因編碼區(qū)和spmA ATG上游100 bp的4.45 kb片段，然后克隆到pME6032[32]中，生成重組質(zhì)粒pME6032-spm100。
構(gòu)建惡臭假單胞菌S16的mfs、sapd、pnao、nicA2基因破壞突變體
通過(guò)PCR從惡臭假單胞菌S16的總DNA中擴(kuò)增mfs、sapd、pnao和nicA2的DNA片段，并克隆到pK18mob的多克隆位點(diǎn)中。PCR引物對(duì)序列如表S6所示。通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化惡臭假單胞菌S16，條件如下：將0.5-1μg DNA加入100μl惡臭假單胞菌S16的電感受態(tài)細(xì)胞中，使用Bio-Rad Gene-Pulser Xcell（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA）在12 kV cm-1、200 Ω、25μF下電擊。
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