大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)埃希氏菌屬(Escherichia)成員之一，一般不致病，多為條件致病菌。1894年，首次有了關于雞大腸埃希氏菌的報道，隨后世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)達國家和地區(qū)逐漸有了關于大腸桿菌病不同病型的報道，由多種致病因子結合的禽致病性大腸埃希氏菌(Avian pathogenicE.coli,APEC)，可導致禽類的多種癥狀，最常見的是死胚、敗血癥、心包炎、卵黃性腹膜炎、關節(jié)炎、氣囊炎、肉芽腫等。由于臨床上抗菌藥物的長期、不合理使用，導致耐藥菌株不斷增多。因此，急切地需要新型藥物的研發(fā)，以控制耐藥性致病菌引起的感染。噬菌體是一種廣泛存在于自然界中的病毒，對其宿主菌具有高效特異性的感染，并且不出現耐藥性。近年來噬菌體已應用于臨床疾病的治療，并具有良好的效果。在現今雞大腸桿菌病治療的基礎上，筆者以本實驗室前期分離得的雞致病性大腸埃希氏菌為宿主菌分離噬菌體，經過篩選得到一株裂解性噬菌體，分析了其部分其生物學特征，并進行了全基因組測序及分析，為該噬菌體用于臨床治療提供基礎。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株和水樣45株雞大腸埃希氏菌均由石河子大學動物傳染病實驗室分離鑒定與保存，污水采于石河子市及周邊養(yǎng)雞場。
1.1.2主要試劑DNaseI、RNase A、Mung Bean Nuclease、病毒總基因提取試劑盒為TaKaRa公司產品；PEG4000為天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心產品；SM緩沖液、PBS緩沖液、LB的液體/半固體/固體培養(yǎng)基均在石河子大學動科院傳染病實驗室進行常規(guī)配制所得。
1.1.3主要儀器高速冷凍離心機(Multifuge XLR)，美國賽默飛世爾科技有限公司產品；透射電子顯微鏡(HT7700)，日立(中國)有限公司產品；測序儀(Miseq)，美國Illumina公司產品。
1.2方法
1.2.1宿主菌的準備將本實驗室保存于-80℃超低溫冰箱中的45株雞大腸埃希氏菌置于4℃環(huán)境下解凍。挑取在LB固體平板上劃線生長出的單一菌落分別接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基中，于37℃、160 r/min條件下過夜富集培養(yǎng)，后置4℃保存。
1.2.2噬菌體的分離與純化
將污水水樣依次經過無菌紗布和濾紙過濾，得到的濾液置于4℃過夜后，再用0.22μm濾膜過濾除菌。取除菌的污水濾液與45株雞大腸埃希氏菌各菌懸液依次加于液體LB培養(yǎng)基中，于錐形瓶中混勻，室溫靜止15 min，37℃、160 r/min培養(yǎng)7 h并于4℃過夜，10 000 r/min離心10 min，取上清液分別與45株雞大腸埃希氏菌菌懸液混合吸附后，用雙層瓊脂平板法過夜培養(yǎng)進行噬菌體的分離。
用無菌牙簽挑取生長良好的單個噬菌空斑至于100μL相應宿主菌，吸附反應15 min，加入5 mL液體LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)5 h，將離心倍比稀釋的培養(yǎng)液與宿主菌混合均勻后采用雙層瓊脂法培養(yǎng)，如此過程重復3次以上，直至在一個平板上形成形態(tài)單一的噬菌斑。即可得到純的噬菌體原液，將其置于-80℃(與500 mL/L甘油等體積混勻)保存和4℃?zhèn)溆谩?
1.2.3噬菌體的濃縮及電鏡觀察
采用超速離心法，進行噬菌體濃縮，將裂解液上清在4℃下24 446×g，離心1.5 h，用SM緩沖液輕輕洗脫重懸每個離心管中的沉淀，最后將得到的濃縮液收集在1.5 mL無菌離心管中保存于-80℃?zhèn)溆?。?0μL噬菌體濃縮液滴于載玻片上，用精細鑷子輕輕夾取銅網(200目)放于噬菌體濃縮液液滴上，室溫下吸附2 min后取出，放于吸水紙上，去除銅網上的液體，滴一滴20 g/L的磷鎢酸染液在銅網上，靜置染色3 min取出，放于吸水紙上，用紅外燈照射30 min，以徹底除去水分與有害雜質后，用HT7700透射電子顯微鏡觀察噬菌體的形態(tài)。
1.2.4噬菌體核酸類型的鑒定
噬菌體基因組的提取嚴格按照病毒基因DNA/RNA提取試劑盒說明書中的操作步驟進行，將提取的核酸于37℃水浴條件下，用DNaseⅠ、RNase A與Mung Bean Nuclease分別對噬菌體的基因組消化2 h后，采用瓊脂凝膠電泳法對消化產物進行檢測。
1.2.5噬菌體全基因組的測序
將噬菌體基因組處理為約290 bp的測序文庫，利用Miseq測序儀完成測序工作，使用軟件Newbler 2.9與CLC 3.0對得到的基因組序列進行序列組裝。測序工作由北京軍事醫(yī)學科學院微生物學流行病學研究所完成。利用MEGA7.0對所得序列進行親緣關系的構建。
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