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貓皰疹病毒Ⅰ型毒株HRB2019分離培養(yǎng)、增殖與鑒定方法（二）

來(lái)源：《畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)》發(fā)布時(shí)間:2025-09-24 16:22:28 瀏覽：165 次

1.4病毒分離培養(yǎng)

將采集的病貓的眼、鼻拭子置于1 mL含有青霉素(1 000 U·mL-1)和鏈霉素(1 000 U·mL-1)的滅菌PBS中，4℃過(guò)夜后取800μL上清接種于單層CRFK細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)，約90%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收集培養(yǎng)基上清并分裝。取每一代上清1 mL接種細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)3次傳代，每一代進(jìn)行PCR/RT-PCR檢測(cè)。

1.5鼠抗FCV多克隆抗體的制備

將傳至第三代獲得的單純FCV病毒培養(yǎng)物，利用20%蔗糖進(jìn)行超速離心，去除雜蛋白。純化后的病毒(1×107PFU·mL-1)用3‰甲醛于4℃滅活24 h，與佐劑體積比1∶1混合。每只小鼠接種100μL混合物，共接種10只小鼠。免疫完成后，利用血清中和試驗(yàn)檢測(cè)抗體中和活性及效價(jià)，細(xì)胞感染FHV-1及FCV后利用間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)血清的特異性。

1.6混合病毒中FHV-1的分離

取40μL混合感染病料拭子細(xì)胞培養(yǎng)第一代產(chǎn)物，1∶1加入1640培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，共80μL，充分混勻后，將其分裝為35、25、10、5μL共4只離心管，再分別向每只離心管中加入80μL鼠抗FCV多克隆抗體，37℃孵育1 h，每管補(bǔ)加1640培養(yǎng)基至200μL后接入長(zhǎng)滿單層CRFK細(xì)胞的24孔板中，37℃孵育1 h，更換為每孔500μL含2%FCV血清的1 640培養(yǎng)基，約90%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，收集培養(yǎng)基上清，連續(xù)傳三代，每一代進(jìn)行PCR/RT-PCR檢測(cè)。

1.7 FHV-1的增殖與鑒定

1.7.1 FHV-1分離株的增殖將單純FHV-1病毒液接入單層CRFK細(xì)胞，使用含2%FBS的1640培養(yǎng)基維持。觀察CPE，待90%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，凍融離心收集上清，－80℃保存?zhèn)溆谩?

1.7.2 FHV-1分離株病毒形態(tài)鑒定分離的FHV-1傳至第四代，1 500 r·min-1離心10 min去除細(xì)胞碎片，收集15 mL細(xì)胞病變上清，將上清10 000 r·min-1離心90 min，棄上清，沉淀用500μL PBS重懸，送至中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所中心電鏡室進(jìn)行病毒粒子形態(tài)的透射電鏡觀察。

1.7.3 FHV-1分離株IFA鑒定將FHV-1分離株接種于6孔板單層CRFK細(xì)胞，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。培養(yǎng)24 h出現(xiàn)明顯CPE時(shí)，棄上清，依次進(jìn)行－20℃預(yù)冷甲醇固定、封閉，加入FHV-1陽(yáng)性血清為一抗、FITC標(biāo)記的山羊抗貓IgG二抗，于熒光倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.7.4 FHV-1分離株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)以感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.01感染CRFK細(xì)胞，吸附1 h后，更換為含2%FBS的1640培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)。分別在12、24、36、48、60、72、84 h收集培養(yǎng)上清，重復(fù)3份，分別測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)上清中的病毒含量。

1.8 FHV-1分離株基因序列分析

提取病毒DNA，按參考文獻(xiàn)所述方法對(duì)FHV-1 gD基因ORF序列進(jìn)行擴(kuò)增(引物序列見表1)。反應(yīng)體系及程序參照LA Taq試劑盒說(shuō)明書。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后按照膠回收試劑盒方法進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒并鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒送至庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果和GenBank上已發(fā)表的FHV-1 gD基因核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并構(gòu)建FHV-1 gD基因系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。

2結(jié)果

2.1病料PCR/RT-PCR檢測(cè)

采集的貓眼鼻拭子PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)HV-1陽(yáng)性、FCV陽(yáng)性、C felis陰性。判定為FHV-1、FCV混合感染。

2.2病毒分離培養(yǎng)

病料拭子接種CRFK細(xì)胞，連續(xù)傳代三次，第一、二代培養(yǎng)上清PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果為FHV-1(625 bp)、FCV(174 bp)陽(yáng)性，且FHV-1第二代培養(yǎng)物條帶亮度降低；第三代只檢測(cè)到FCV(圖1)。傳代過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)CV與FHV-1相比，病變速度極快，具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，由此分離出FCV。

M.DL2000 DNA Marker；1.FHV-1陽(yáng)性對(duì)照；2~4.病料拭子1~3代培養(yǎng)物FHV-1檢測(cè)結(jié)果；5.FHV-1陰性對(duì)照；6.FCV陽(yáng)性對(duì)照；7~9.病料拭子1~3代培養(yǎng)物FCV檢測(cè)結(jié)果；10.FCV陰性對(duì)照

圖1病料拭子分離培養(yǎng)三代產(chǎn)物PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3鼠抗FCV多克隆抗體的制備

FCV分離株經(jīng)超離純化后，病毒滴度為1.3×108PFU·mL-1，免疫小鼠制得的多克隆抗體，針對(duì)親本株FCV的中和效價(jià)>1 280。IFA鑒定特異性結(jié)果顯示，此多抗只與FCV結(jié)合產(chǎn)生較明亮的特異性綠色熒光，與FHV-1的反應(yīng)結(jié)果和空白對(duì)照細(xì)胞相當(dāng)(圖2)，無(wú)明顯熒光，說(shuō)明鼠抗FCV多克隆抗體特異性較高，可用于中和混合病毒里的FCV粒子。

A.感染FCV的CRFK細(xì)胞；B.感染FHV-1的CRFK細(xì)胞；C.正常CRFK細(xì)胞

圖2 FCV抗體特異性檢測(cè)結(jié)果(200×)

2.4混合病毒中FHV-1的分離

35μL(A組)、25μL(B組)、10μL(C組)、5μL(D組)的第一代細(xì)胞培養(yǎng)物與80μL鼠抗FCV多克隆抗體混合后接種細(xì)胞，連續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，命名為混合1代、2代和3代。結(jié)果顯示，A、B組的混合1代~3代均觀察到CPE：其中混合1代PCR/RT-PCR檢測(cè)FHV-1(625 bp)、FCV(174 bp)均陽(yáng)性，混合2代、3代PCR/RT-PCR檢測(cè)FHV-1陰性、FCV陽(yáng)性；C組混合1、2代未觀察到CPE，PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果FHV-1、FCV均陰性，第3代觀察到CPE，PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果FHV-1陽(yáng)性、FCV陰性；D組三代均未觀察到CPE，且PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果FHV-1、FCV均陰性(圖3)。C組完全中和混合病毒中的FCV，成功分離出FHV-1，命名為HRB2019株。

圖3利用FCV血清中和試驗(yàn)分離混合病毒中的FHV-1

A~D.分別對(duì)應(yīng)A~D組。泳道：M.DL2000 DNA Marker；1.FHV-1陽(yáng)性對(duì)照；2~4.病料拭子1~3代培養(yǎng)物FHV-1檢測(cè)結(jié)果；5.FHV-1陰性對(duì)照；6.FCV陽(yáng)性對(duì)照；7~9.病料拭子1~3代培養(yǎng)物FCV檢測(cè)結(jié)果；10.FCV陰性對(duì)照

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