摘要
抗生素耐藥性上升和有效抗病毒藥物數(shù)量稀少構(gòu)成了全球公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)。本研究聚焦于靶向宿主泛素系統(tǒng)的新型抗感染策略，篩選了39種2-氰基-3-丙烯酰胺類DUB抑制劑，成功鑒定出化合物C6在巨噬細(xì)胞中對鼠諾如病毒(MNV-1)和李斯特菌(10403S)展現(xiàn)出顯著的抗感染活性。C6表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性（在1.0μM濃度下細(xì)胞活力保持80%以上）及優(yōu)異的藥代動力學(xué)特性，其在小鼠肝微粒體中的半衰期約為20分鐘，靜脈注射后在小鼠體內(nèi)的半衰期約為4小時。這些發(fā)現(xiàn)不僅為基于宿主的抗感染治療提供了新思路，還為開發(fā)廣譜抗感染藥物奠定了重要基礎(chǔ)。研究中采用Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀進行細(xì)菌生長動力學(xué)分析，確保了實驗數(shù)據(jù)的精確性和可靠性。
引言
隨著抗生素耐藥性問題的日益嚴(yán)峻以及有效抗病毒藥物的匱乏，尋找新的傳染病治療方法已成為全球醫(yī)學(xué)界的重要課題。近年來，基于宿主的治療策略逐漸成為藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的新興方向。該策略的核心在于通過增強宿主免疫系統(tǒng)對病原體的反應(yīng)能力，而非直接靶向病原體本身，從而降低病原體快速進化耐藥性的風(fēng)險。在此背景下，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)作為真核細(xì)胞信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，成為極具潛力的治療靶點。去泛素化酶（DUB）是這一系統(tǒng)中的重要組成部分，負(fù)責(zé)去除蛋白質(zhì)上的泛素標(biāo)記，進而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞周期和凋亡等。研究表明，DUB在宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因此，開發(fā)選擇性DUB抑制劑有望為傳染病治療提供全新的解決方案。抗生素耐藥性與抗病毒藥物匱乏推動宿主導(dǎo)向療法興起，其通過調(diào)控宿主免疫而非直接靶向病原體降低耐藥風(fēng)險。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是關(guān)鍵靶點，去泛素化酶（DUB）調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞周期等免疫相關(guān)過程，開發(fā)選擇性DUB抑制劑為傳染病治療提供新方向。
本研究聚焦于一種新型小分子DUB抑制劑——化合物C6，旨在評估其在巨噬細(xì)胞中對兩種不同類型的胞內(nèi)病原體——鼠諾如病毒（MNV）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的抗感染活性。這兩種病原體分別代表了病毒性和細(xì)菌性感染，且均能在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，這使得它們成為研究宿主導(dǎo)向療法的理想模型。MNV是一種無包膜的單鏈RNA病毒，屬于杯狀病毒科，是全球范圍內(nèi)引起急性胃腸炎的主要病原體之一，每年在全球范圍內(nèi)造成數(shù)以億計的病例。相比之下，李斯特菌則是一種廣泛存在于環(huán)境中的革蘭氏陽性細(xì)菌，可通過污染的食物傳播，導(dǎo)致嚴(yán)重的食源性疾病，尤其在老年人、孕婦和免疫功能低下人群中可引發(fā)致命的腦膜炎或敗血癥。盡管這兩種病原體在生物學(xué)特性上存在顯著差異，但它們都依賴于宿主細(xì)胞的內(nèi)部環(huán)境進行復(fù)制，因此，通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞的功能來抑制其復(fù)制，成為一種潛在的廣譜抗感染策略。本研究聚焦新型DUB抑制劑C6，評估其對巨噬細(xì)胞內(nèi)鼠諾如病毒（MNV，病毒性模型）和單核細(xì)胞增生李斯特菌（細(xì)菌性模型）的抗感染活性。二者均依賴宿主細(xì)胞復(fù)制，MNV致全球急性胃腸炎，李斯特菌引發(fā)高危人群致命性食源性疾病，靶向宿主功能的策略或具廣譜抗感染潛力。
為了系統(tǒng)地評估化合物C6的抗感染效果，本研究采用了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炘O(shè)計。首先，研究人員構(gòu)建了一個包含39種小分子DUB抑制劑的化合物庫，這些化合物在結(jié)構(gòu)上與已知的先導(dǎo)化合物WP1130及其衍生物G9相關(guān)。通過對該化合物庫的篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)化合物C6不僅在細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出顯著的抗感染活性，而且其細(xì)胞毒性遠(yuǎn)低于先導(dǎo)化合物G9。更重要的是，化合物C6能夠在人和鼠源性巨噬細(xì)胞中有效抑制DUB活性，從而減少MNV和李斯特菌的胞內(nèi)復(fù)制。這一發(fā)現(xiàn)為開發(fā)基于宿主泛素系統(tǒng)的抗感染藥物提供了重要的理論依據(jù)。此外，代謝穩(wěn)定性和藥代動力學(xué)研究表明，化合物C6在小鼠肝微粒體中的半衰期約為20分鐘，靜脈注射后在小鼠體內(nèi)的半衰期約為4小時，顯示出良好的體內(nèi)穩(wěn)定性。這些數(shù)據(jù)表明，化合物C6不僅具有強大的體外抗感染活性，還具備進一步開發(fā)為體內(nèi)治療藥物的潛力。研究篩選39種與WP1130/G9相關(guān)的DUB抑制劑，發(fā)現(xiàn)C6抗感染活性顯著且細(xì)胞毒性低于G9，可抑制人/鼠巨噬細(xì)胞DUB活性以減少病原體復(fù)制。代謝穩(wěn)定性顯示其小鼠肝微粒體半衰期20分鐘，靜脈注射體內(nèi)半衰期4小時，兼具體外活性與體內(nèi)開發(fā)潛力。
本研究的意義不僅在于鑒定了一種具有廣譜抗感染活性的新型DUB抑制劑，更在于為宿主導(dǎo)向療法的發(fā)展提供了新的思路。傳統(tǒng)的抗菌和抗病毒藥物通常直接作用于病原體，容易導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。而通過靶向宿主細(xì)胞的關(guān)鍵調(diào)控通路，如泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，可以從根本上改變宿主細(xì)胞對病原體的易感性，從而實現(xiàn)更為持久和廣泛的抗感染效果。此外，化合物C6的成功篩選也為后續(xù)藥物開發(fā)提供了寶貴的參考，尤其是在優(yōu)化化合物的類藥物性質(zhì)方面。未來的研究將進一步探索C6的具體作用機制，包括其對特定DUB的抑制活性以及對宿主細(xì)胞信號通路的影響，以期為開發(fā)更安全、更有效的抗感染藥物奠定堅實的基礎(chǔ)。本研究不僅鑒定了廣譜抗感染的C6，更拓展了宿主導(dǎo)向療法思路。傳統(tǒng)藥物易致耐藥，而靶向泛素-蛋白酶體系統(tǒng)可持久改變宿主對病原體的易感性，為后續(xù)藥物優(yōu)化提供參考，未來需進一步探索其作用靶點與信號通路影響。
材料與方法
化合物和試劑。所有化合物溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，分裝并在-20°C儲存。測試化合物由Evotec Ltd.（英國阿賓頓）或密歇根大學(xué)Vahlteich藥物化學(xué)核心實驗室合成，并在補充材料的表S1至S3中顯示?；衔锿ㄟ^先前描述的方法合成（49）。所有具有手性中心的化合物都是外消旋混合物。
細(xì)胞培養(yǎng)以及細(xì)菌和病毒株。RAW 264.7巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系（此處稱為RAW）（ATCC TIB-71）在DMEM-10培養(yǎng)基（Gibco DMEM[11995-065]，含4.5 g/L D-葡萄糖和110 mg/L丙酮酸鈉，10%胎牛血清[HyClone]，1%青霉素-鏈霉素[15140-122;Gibco]，1%HEPES緩沖液[1 M;15630-080;Gibco]，1%非必需氨基酸[100x;11140-050;Gibco]和1%L-谷氨酰胺[200 mM;25030-081;Gibco]）中于37°C和5%CO2的組織培養(yǎng)瓶中維持。純化克隆的MNV-1（GV/MNV1/2002/USA）MNV-1.CW3（50）（此處稱為MNV-1）在所有實驗中使用的傳代次數(shù)為6（如參考文獻(xiàn)37所述）。李斯特菌菌株10403S在腦心浸液或LB瓊脂平板上培養(yǎng)，或在感染前在液體BHI培養(yǎng)基中生長。
細(xì)菌感染試驗。將李斯特菌單菌落接種于2 ml BHI液體培養(yǎng)基中，不通氣，37°C過夜培養(yǎng)。RAW細(xì)胞在24孔板（3524;Costar）中以4×10^5細(xì)胞/板的密度在DMEM-10中生長，并在37°C和5%CO2下孵育過夜。為了制備接種物，將BHI中的過夜培養(yǎng)物用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）（10010-023;Gibco）稀釋至10^8 CFU/ml。感染前，培養(yǎng)基更換為含測試化合物指定濃度且無抗生素的溫培養(yǎng)基（DMEM-Abx），細(xì)胞在37°C和5%CO2下孵育30分鐘。然后從細(xì)胞中移除含化合物的培養(yǎng)基，更換為含MOI為1（或0.1）的李斯特菌的DMEM，在37°C和5%CO2下孵育30分鐘。然后吸出培養(yǎng)基，用溫DPBS（含鈣和氯化鎂）洗滌細(xì)胞三次，并向細(xì)胞中加入含10μg/ml慶大霉素（和指定測試化合物）的培養(yǎng)基。在指定時間點，移除培養(yǎng)基并更換為1 ml 0.1%Triton X-100，然后刮取細(xì)胞，加入3.5 ml蒸餾水，渦旋12秒以裂解RAW細(xì)胞。然后向樣品中加入PBS（10x），使最終濃度為1×PBS，并在LB瓊脂平板上鋪板以計數(shù)胞內(nèi)CFU。
細(xì)菌生長曲線。為了評估測試化合物對野生型李斯特菌菌株10403S生長的毒性，將細(xì)菌培養(yǎng)至600 nm光密度（OD600）為0.5，并在含無DUB抑制劑（未處理）或終濃度為2.5和5.0μM的化合物C6的BHI肉湯中1:10稀釋，并在含DMSO（載體對照）的培養(yǎng)基中體積與測試化合物匹配。然后將培養(yǎng)物移至100孔Honeycomb 2板（編號950255）中，每孔300μl，一式三份，在Bioscreen C生長曲線儀器中生長。板在37°C連續(xù)中速振蕩孵育18小時，并用Prism6軟件在線性刻度上繪制。
病毒感染與細(xì)菌感染：RAW細(xì)胞用化合物預(yù)處理30分鐘后感染MNV-1(MOI=5)或李斯特菌(MOI=1)。感染后1、4和8小時測定病毒滴度（通過TCID50）或胞內(nèi)細(xì)菌計數(shù)（通過菌落形成單位CFU）。細(xì)胞活力通過MTT法測定。
代謝穩(wěn)定性試驗：使用小鼠肝微粒體進行代謝穩(wěn)定性測試，化合物C6在小鼠肝微粒體中的半衰期約為20分鐘。反應(yīng)體系包含0.5 mg/mL肝微粒體、100μM化合物C6和NADPH再生系統(tǒng)，37°C孵育15-60分鐘，通過HPLC測定化合物剩余量。
藥代動力學(xué)研究：化合物C6通過尾靜脈或口服給予C57BL/6小鼠（n=6/組），于0.5、1、2、4、6、8、12、24小時采集血漿樣本，使用LC-MS/MS檢測血漿中化合物濃度，計算藥代動力學(xué)參數(shù)。
細(xì)胞毒性評估：在多種細(xì)胞處理策略下評估C6的細(xì)胞毒性，包括2.5μM預(yù)處理后，在1.0μM C6存在下孵育24小時，細(xì)胞活力通過MTT法測定。
相關(guān)新聞推薦
1、結(jié)核分枝桿菌蛋白Rv2029c促進大腸埃希菌生長及糖酵解能力——摘要、材料與方法