結(jié)果
1.化合物C6在細(xì)胞培養(yǎng)中減少M(fèi)NV-1和李斯特菌的胞內(nèi)感染
篩選39種2-氰基-3-丙烯酰胺類DUB抑制劑，發(fā)現(xiàn)化合物C6和E3在細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)MNV-1和李斯特菌均表現(xiàn)出顯著的抗感染活性，且毒性低于先導(dǎo)化合物G9。C6在5μM濃度下處理8小時(shí)后，對(duì)MNV-1的復(fù)制抑制超過兩個(gè)數(shù)量級(jí)（從10?TCID50/mL降至10?TCID50/mL），對(duì)李斯特菌的胞內(nèi)復(fù)制抑制達(dá)到載體處理細(xì)胞的28.3%。值得注意的是，C6在低濃度（1.0μM）下仍保持顯著活性，表明其高效力。
2.化合物C6的去泛素化酶活性
化合物C6在人類細(xì)胞中表現(xiàn)出DUB抑制活性，與先導(dǎo)化合物WP1130相似。在RAW細(xì)胞中，C6處理導(dǎo)致多泛素化蛋白質(zhì)水平顯著增加（約3.5倍），表明C6在鼠細(xì)胞中也有效抑制DUB活性。Western blot分析顯示，C6處理后，泛素化蛋白聚集體在細(xì)胞質(zhì)中明顯增多，這與DUB抑制的預(yù)期效果一致。
3.化合物C6對(duì)李斯特菌在無細(xì)胞培養(yǎng)中生長(zhǎng)的影響
在體外肉湯生長(zhǎng)試驗(yàn)中，C6對(duì)李斯特菌生長(zhǎng)有輕微的劑量依賴性抑制（IC50=25μM），但不影響細(xì)菌的總體生長(zhǎng)能力（OD600在24小時(shí)內(nèi)無顯著差異）。這表明C6的抗感染活性主要通過宿主細(xì)胞機(jī)制而非直接抗菌作用實(shí)現(xiàn)。
4.化合物C6的細(xì)胞毒性評(píng)估
在多種細(xì)胞處理策略下評(píng)估C6的細(xì)胞毒性。在2.5μM預(yù)處理后，于1.0μM C6存在下孵育，細(xì)胞活力保持在80%以上（MTT法測(cè)定），表明C6具有良好的細(xì)胞相容性。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示，C6處理細(xì)胞無明顯形態(tài)改變，無凋亡或壞死跡象。
5.化合物C6在低濃度和更長(zhǎng)暴露時(shí)間下的抗感染活性
使用2.5μM C6預(yù)處理，隨后在1.0μM C6存在下孵育，C6在感染后8小時(shí)顯著抑制MNV-1復(fù)制（抑制率>90%），對(duì)李斯特菌的胞內(nèi)復(fù)制也有顯著抑制作用（抑制率72%）。與先導(dǎo)化合物G9相比，C6在低濃度下活性更優(yōu)，且毒性更低。
6.化合物C6對(duì)病原體攝取的影響
光敏感病毒試驗(yàn)表明，C6不影響MNV-1的攝?。ㄍㄟ^熒光標(biāo)記病毒測(cè)定），表明其抗病毒作用定位于病毒生命周期的后期階段。對(duì)于李斯特菌，C6處理減慢了RAW細(xì)胞的吞噬作用（吞噬率降低35%），這可能部分解釋了胞內(nèi)細(xì)菌復(fù)制的降低。
7.化合物C6在小鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)分析
代謝穩(wěn)定性試驗(yàn)顯示，C6在小鼠肝微粒體中的半衰期約為20分鐘，表明其在肝代謝中相對(duì)穩(wěn)定。靜脈注射后，C6在小鼠體內(nèi)的半衰期約為4小時(shí)，血漿濃度在7小時(shí)內(nèi)保持較高水平（AUC??∞=128.5μg·h/mL）。與先導(dǎo)化合物G9相比（半衰期1.5小時(shí)），C6在體內(nèi)表現(xiàn)出更有利的藥代動(dòng)力學(xué)特性?？诜o藥后，C6的生物利用度為45%，表明其口服吸收良好。這些藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)支持C6進(jìn)一步開發(fā)為體內(nèi)治療藥物。
討論
本研究鑒定出化合物C6作為具有前景的抗感染候選化合物。C6在巨噬細(xì)胞中抑制DUB活性，增強(qiáng)宿主對(duì)MNV-1和李斯特菌的抗感染能力，同時(shí)表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性。C6的藥代動(dòng)力學(xué)特性表明其在體內(nèi)應(yīng)用的潛力：在小鼠肝微粒體中約20分鐘的半衰期雖較短，但靜脈注射后在小鼠體內(nèi)約4小時(shí)的半衰期表明其在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，這歸因于C6對(duì)肝微粒體代謝的抵抗性。與先導(dǎo)化合物G9相比，C6的代謝穩(wěn)定性提高，這是由于其結(jié)構(gòu)優(yōu)化減少了代謝位點(diǎn)。
C6的抗感染機(jī)制可能涉及多種宿主通路。DUB抑制劑WP1130已知影響巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的定位和未折疊蛋白反應(yīng)，C6可能通過類似機(jī)制發(fā)揮作用。我們推測(cè)，C6抑制特定DUB（如USP25或UCHL1），導(dǎo)致泛素化蛋白積累，激活NF-κB信號(hào)通路，增強(qiáng)炎癥因子產(chǎn)生和抗菌肽表達(dá)，從而清除胞內(nèi)病原體。鑒定C6抑制的具體DUB及其在感染巨噬細(xì)胞中的靶蛋白是未來研究的關(guān)鍵方向。
值得注意的是，MNV和李斯特菌都是胞內(nèi)病原體，能在巨噬細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。C6通過增強(qiáng)宿主細(xì)胞的抗菌能力，使巨噬細(xì)胞重新獲得有效清除感染的能力。這與傳統(tǒng)的靶向病原體的治療策略不同，可能減少病原體產(chǎn)生耐藥性的可能性。在臨床應(yīng)用中，C6的低細(xì)胞毒性（IC50>10μM）和良好的藥代動(dòng)力學(xué)特性使其成為理想的候選藥物。
結(jié)論
化合物C6是具有前景的抗感染候選化合物，它在細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)MNV-1和李斯特菌表現(xiàn)出顯著的抗感染活性（MNV-1抑制>90%，李斯特菌抑制72%），同時(shí)具有較低的細(xì)胞毒性（細(xì)胞活力>80%）。C6在小鼠肝微粒體中的半衰期約為20分鐘，靜脈注射后在小鼠體內(nèi)的半衰期約為4小時(shí)，這些藥代動(dòng)力學(xué)特性支持其進(jìn)一步開發(fā)為體內(nèi)治療藥物。
本研究為基于宿主的抗感染治療提供了新思路，表明靶向宿主泛素系統(tǒng)可能是開發(fā)廣譜抗感染藥物的有效策略。未來研究將聚焦于C6抑制的具體DUB、其在感染巨噬細(xì)胞中的作用機(jī)制，以及在動(dòng)物模型中的抗感染活性評(píng)估。Bioscreen C全自動(dòng)微生物生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用為本研究提供了可靠的細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性和可重復(fù)性。
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