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?河南省豬流行性腹瀉病毒（PEDV）流行毒株的遺傳變異、生長(zhǎng)特性及滅活疫苗研制研究（一）

來(lái)源：發(fā)布時(shí)間:2025-09-23 17:31:02 瀏覽：144 次

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的一種以嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床特征的急性、高度接觸性腸道傳染病，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。為掌握河南省當(dāng)前PEDV流行毒株的遺傳變異趨勢(shì)、病毒生物學(xué)特性，并為新型高效疫苗的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，本研究于2020年至2021年底在河南省范圍內(nèi)采集499份仔豬腹瀉病料，開(kāi)展分子流行病學(xué)調(diào)查、病毒分離鑒定、全基因組測(cè)序分析、病毒體外復(fù)制動(dòng)態(tài)（生長(zhǎng)曲線）測(cè)定及滅活疫苗的研制與免疫效果評(píng)價(jià)。

結(jié)果顯示，499份樣品中PEDV陽(yáng)性162份，陽(yáng)性率為35.2%。對(duì)其中21株流行毒株S基因測(cè)序分析表明，其核苷酸同源性為96.9%～100%，氨基酸同源性為95.2%～100%，均屬于GIIb進(jìn)化群，且S蛋白存在7處規(guī)律性新突變。成功分離獲得兩株強(qiáng)毒株CHHNKF03和CHHNPDS01，全基因組分析顯示其與國(guó)內(nèi)近年流行毒株核苷酸同源性為95.6%～98.7%，亦歸屬GIIb群。病毒體外復(fù)制動(dòng)態(tài)測(cè)定（生長(zhǎng)曲線）顯示，CHHNKF03株在感染后24小時(shí)達(dá)到病毒滴度峰值（10?.?TCID??/0.1 mL），而CHHNPDS01株在30小時(shí)達(dá)峰（10?.?TCID??/0.1 mL），提示兩株病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)存在差異?；贑HHNKF03株研制的滅活疫苗經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)條件（MOI=0.01，收毒時(shí)間24 h）、滅活工藝及Freemix水性佐劑篩選后，免疫妊娠母豬可誘導(dǎo)良好免疫應(yīng)答，仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)顯示免疫組保護(hù)率達(dá)80%，顯著高于商品化疫苗組（60%）和對(duì)照組（20%）。本研究系統(tǒng)揭示了河南地區(qū)PEDV流行毒株的遺傳演化特征與體外復(fù)制規(guī)律，為PEDV的精準(zhǔn)防控及新型疫苗研發(fā)提供了重要理論與實(shí)踐基礎(chǔ)。

1.引言

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬，自2010年以來(lái)在我國(guó)廣泛流行，尤其是GII型變異毒株的出現(xiàn)導(dǎo)致原有疫苗保護(hù)效果下降，疫情反復(fù)爆發(fā)。河南省作為我國(guó)生豬養(yǎng)殖大省，PED疫情形勢(shì)嚴(yán)峻。為應(yīng)對(duì)病毒持續(xù)變異帶來(lái)的防控挑戰(zhàn)，亟需掌握本地流行毒株的遺傳特征、復(fù)制能力及致病性，并基于當(dāng)前流行株開(kāi)發(fā)高效疫苗。

本研究聚焦河南省PEDV流行現(xiàn)狀，通過(guò)分子流行病學(xué)調(diào)查明確流行率，分離鑒定代表性毒株，重點(diǎn)分析其體外復(fù)制動(dòng)態(tài)（生長(zhǎng)曲線），并基于分離株開(kāi)展滅活疫苗研制與免疫效果評(píng)估，旨在為PED的科學(xué)防控提供數(shù)據(jù)支持和技術(shù)儲(chǔ)備。

2.材料與方法

2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程

實(shí)驗(yàn)流程主要包括三個(gè)階段：

1.分子流行病學(xué)調(diào)查：采集腹瀉病料→RNA提取→RTPCR檢測(cè)→S基因測(cè)序與遺傳進(jìn)化分析；

2.病毒分離鑒定與全基因組測(cè)序：PEDV陽(yáng)性樣品接種Vero細(xì)胞盲傳→CPE觀察→RTPCR與IFA鑒定→透射電鏡觀察→病毒滴度測(cè)定與生長(zhǎng)曲線構(gòu)建→全基因組測(cè)序與進(jìn)化分析→仔豬回歸試驗(yàn)驗(yàn)證致病性；

3.滅活疫苗研制與免疫評(píng)價(jià)：優(yōu)化病毒培養(yǎng)條件→滅活工藝驗(yàn)證→佐劑篩選→妊娠母豬免疫→仔豬攻毒保護(hù)試驗(yàn)。

2.2分子流行病學(xué)調(diào)查

采集2020–2021年河南省499份仔豬腹瀉病料，提取RNA后采用RTPCR擴(kuò)增PEDV N基因進(jìn)行篩查。陽(yáng)性樣品進(jìn)一步擴(kuò)增S基因并測(cè)序，選取21株進(jìn)行同源性比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析。

2.3病毒分離與鑒定

將RTPCR陽(yáng)性病料接種于Vero細(xì)胞，連續(xù)盲傳至出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），包括細(xì)胞圓縮、聚集、融合形成合胞體等。收獲病毒液后進(jìn)行RTPCR和間接免疫熒光（IFA）鑒定，并通過(guò)透射電鏡觀察病毒形態(tài)。

2.4病毒滴度測(cè)定與生長(zhǎng)曲線構(gòu)建（重點(diǎn)）

2.4.1 TCID??測(cè)定

采用ReedMuench法測(cè)定病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID??）。將分離株CHHNKF03和CHHNPDS01進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)臃N6孔板Vero細(xì)胞，每孔0.1 mL，設(shè)8個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)5天，觀察CPE。計(jì)算結(jié)果顯示：

CHHNKF03株TCID??=10?.?/0.1 mL

CHHNPDS01株TCID??=10?.?/0.1 mL

2.4.2病毒體外復(fù)制動(dòng)態(tài)測(cè)定（生長(zhǎng)曲線）

為明確兩株病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)特征，進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定：

將CHHNKF03和CHHNPDS01株以MOI=0.01接種Vero細(xì)胞（6孔板）；

分別于感染后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h收集病毒液（含上清與細(xì)胞）；

每時(shí)間點(diǎn)做3個(gè)重復(fù)，凍融3次后測(cè)定病毒滴度（TCID??/0.1 mL）；

繪制病毒滴度隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線。

2.4.3不同感染復(fù)數(shù)（MOI）與收毒時(shí)間優(yōu)化

為后續(xù)疫苗生產(chǎn)優(yōu)化工藝，進(jìn)一步研究CHHNKF03株在不同MOI（0.002、0.006、0.01、0.03、0.1）下的復(fù)制動(dòng)態(tài)，于感染后6–36 h每隔6 h收毒測(cè)滴度。

2.5全基因組測(cè)序與遺傳進(jìn)化分析

提取病毒RNA，通過(guò)RTPCR擴(kuò)增全基因組并測(cè)序。利用MEGA軟件進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，參考GenBank中52株國(guó)內(nèi)2011–2019年流行毒株序列。

2.6滅活疫苗研制

病毒培養(yǎng)條件優(yōu)化：比較不同MOI與收毒時(shí)間對(duì)病毒產(chǎn)量的影響；

滅活工藝：采用BEI（2溴乙基異氰酸酯）或甲醛滅活，驗(yàn)證滅活徹底性；

佐劑篩選：測(cè)試Freemix、油佐劑、鋁膠等不同佐劑配苗后的免疫效果；

免疫程序：妊娠母豬產(chǎn)前40天和20天各免疫一次，每次2 mL；

攻毒保護(hù)試驗(yàn)：仔豬出生后7日齡口服強(qiáng)毒攻擊，觀察臨床癥狀與死亡情況，計(jì)算保護(hù)率。

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