1、材料與方法
1.1菌株來源及培養(yǎng)條件
實驗所用的食源性致病菌菌株[原始數(shù)據(jù)存儲在國家微生物科學數(shù)據(jù)中心，編號為NMDCX0002088]購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其余菌株則保藏于寧波大學海洋生物病毒研究室菌種庫。LB半固體培養(yǎng)基：瓊脂的質(zhì)量分數(shù)為0.75%的LB培養(yǎng)基；LB固體培養(yǎng)基：瓊脂的質(zhì)量分數(shù)為1.5%的LB培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件：37℃、150 r/min。
1.2噬菌體的分離純化
于浙江省寧波市北侖區(qū)路林市場(29.906 300°N，121.605 903°E)下水道采集表層水樣(2023年04月25日)，低溫運送至實驗室后在4℃、8 000×g離心10 min，取上清依次經(jīng)0.45μm和0.22μm孔徑的聚醚砜濾膜過濾。取CICC 10869用LB肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600≈0.6)。為了富集噬菌體，將40 mL對數(shù)期菌液、40 mL上述水樣濾液和40 mL 3×LB液體培養(yǎng)基于錐形瓶中混合，37℃、150 r/min培養(yǎng)3 h；同期將40 mL對數(shù)期菌液、40 mL純水和40 mL 3×LB的混合液作為對照組培養(yǎng)。將實驗組裂解澄清的培養(yǎng)液在4℃、8 000×g離心10 min，取上清液依次經(jīng)0.45μm和0.22μm孔徑的聚醚砜濾膜過濾，得到的過濾液即為噬菌體富集液。
采用雙層瓊脂平板法進行噬菌體純化，3代后獲得形態(tài)、大小均一的噬菌斑。挖取單個噬菌斑至5 mL新鮮培養(yǎng)的CICC 10869菌液中，37℃、150 r/min培養(yǎng)至裂解澄清，同期設置未加噬菌斑的菌液作為對照組。
Yen-yong1在菌苔上形成的透明噬菌斑周圍具有半透明暈圈(halo)。噬菌體透明噬菌斑周圍的半透明暈圈是由于暈圈所在位置的細菌在未被噬菌體感染時，其胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)被噬菌體的自由擴散的解聚酶降解造成的。噬菌斑周圍是否具有半透明暈圈被認為是判斷噬菌體是否具有解聚酶(depolymerase)的最直觀方法。解聚酶通常具有高耐熱性，而噬菌體通常不耐高溫，可以基于如下原理進行解聚酶活性驗證：將噬菌體懸液高溫(如70℃)處理以滅活噬菌體后，點至菌平板上孵育，如噬菌體有解聚酶則會在菌苔上相應區(qū)域形成半透明的暈圈。因此，進一步檢測Yen-yong1的解聚酶活性：將噬菌體Yen-yong1懸液在70℃下孵育30 min使Yen-yong1滅活，然后滴至CICC 10869瓊脂平板上(2.5μL/點)進行點斑實驗，觀察是否在菌苔上形成半透明暈圈。
1.3噬菌體的形態(tài)學觀察
取新鮮培養(yǎng)的噬菌體-菌裂解液滴至銅網(wǎng)(200目)上，靜置10 min后用中性濾紙吸去多余水分，用2%乙酸鈾酰負染色30 s，用中性濾紙吸去多余染色劑，靜置10 min后在透射電鏡(Hitachi公司)下觀察噬菌體形態(tài)。
1.4噬菌體的基因組提取與測序
進行噬菌體的基因組提取、測序與拼接。取噬菌體-菌裂解液離心、過濾后，取上清液濾液，加入DNase I和RNase A酶解污染的宿主核酸后，采用經(jīng)典的酚/氯仿法提取噬菌體DNA，用NEBNext UltraⅡDNA Library Prep Kit for Illumina(New England Biolabs,NEB公司)按照說明書構建基因組文庫。使用Illumina PE300試劑盒，在Illumina MiSeq上進行測序，用Trimmomatic v0.36軟件去除低質(zhì)量值的測序reads(Q-value<20)，使用SPAdes v3.13.0軟件對過濾后的數(shù)據(jù)進行拼接。
1.5噬菌體基因組注釋
使用童貽剛教授團隊研發(fā)的方法和軟件PhageTerm對噬菌體基因組的末端進行分析。
使用在線工具RAST對噬菌體Yen-yong1的基因組進行初步的開放閱讀框(open reading frames,ORFs)預測與注釋。在此基礎上，使用BLASTp、HHpred和HMMER對預測的所有ORFs進行驗證和校準。使用PerL語言腳本構建噬菌體的基因圖譜(genome map)，并用Inkscape作圖軟件對矢量圖進行美化。
使用在線工具tRNAscan-SE對噬菌體基因組中的tRNA進行在線預測。
使用VFDB數(shù)據(jù)庫檢測噬菌體基因組中是否含有毒力因子基因。
用CARD數(shù)據(jù)庫分析噬菌體基因組中是否含有耐藥基因。
1.6噬菌體系統(tǒng)進化地位分析
使用NCBI提供的BLASTn搜索與Yen-yong1基因組同源的序列，所選數(shù)據(jù)庫為nucleotide collection。
使用PASC計算公共數(shù)據(jù)庫中的所有病毒與Yen-yong1基因組間的成對核苷酸序列相似度值(PASC值)。
使用在線工具ViPTree，基于tBLASTx計算的全基因組序列相似性，以公共數(shù)據(jù)庫中所有病毒基因組(共7 002株)作為參考序列與Yen-yong1一同構建總蛋白譜系統(tǒng)進化樹(proteomic tree)。在此基礎上，選取在總進化樹中與Yen-yong1進化距離最近的3株病毒(Escherichia phage HK639、Cronobacter phage phiES15、Aeromonas phage pAEv1818)、在BLASTn和PASC比對中與Yen-yong1相似性最高的病毒、在國際病毒分類委員會(ICTV)分類系統(tǒng)中各單元中的代表性噬菌體以及在ICTV中有分類地位的11株小腸結腸炎耶爾森氏菌噬菌體的基因組作為參考序列，構建精細蛋白譜系統(tǒng)進化樹。用Inkscape作圖軟件對矢量圖進行美化。
使用在線工具EzBioCloud中的ANI Calculator工具計算Yen-yong1和在進化樹中與之進化距離最近的3株病毒之間的平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)。使用在線工具Genome-to-Genome Distance Calculator計算Yen-yong1和在進化樹中與之進化距離最近的3株病毒之間的DNA分子原位雜交值(in silico DNA-DNA hybridization,isDDH)。使用在線工具The virus intergenomic distance calculator計算Yen-yong1與進化樹中進化距離最近的3株病毒的基因組間的成對基因組間相似性(VIRIDIC值)。
用Easyfig軟件[30]構建Yen-yong1和與之親緣關系最近的噬菌體之間的基因組相似性比較圖。
使用在線工具VirClust分析Yen-yong1與近源噬菌體間共享的核心基因(core gene)。
1.7宿主范圍和成斑率(efficiency of plating,EOP)測定
采用點斑法檢測Yen-yong1的宿主范圍，供試菌共65株(編號為NMDCX0002088)。分別將200μL對數(shù)期菌液(2.38×107 CFU/mL)與4 mL LB半固體培養(yǎng)基混勻，傾倒在LB固體培養(yǎng)基上，制成雙層瓊脂平板。凝固后，在平板上等間隔滴加噬菌體懸液(2.5μL/點，1.95×109 PFU/mL)。將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。若試驗平板上出現(xiàn)明顯的透明噬菌斑，則認為噬菌體裂解該菌株，為陽性結果；反之則認為噬菌體不能裂解該菌株，為陰性結果。每個菌株重復3次點斑實驗。參照文獻[32]，采用雙層瓊脂平板法測定Yen-yong1(1.95×109 PFU/mL)在各個宿主菌株菌苔上出現(xiàn)的噬菌斑數(shù)，以在指示菌株CICC 10869菌苔上出現(xiàn)的平均噬菌斑數(shù)為分母，以其他易感菌菌苔上的噬菌斑數(shù)為分子，計算Yen-yong1在其他易感菌的成斑率。EOP實驗重復3次。
1.8噬菌體的一步生長曲線
參照文獻[33-34]測定Yen-yong1對指示菌CICC 10869的最佳感染復數(shù)(optimal multiplicity of infection,MOI)和最佳吸附時間。
取新鮮培養(yǎng)的CICC 10869對數(shù)期菌液(OD600≈0.6)與Yen-yong1按最佳MOI(MOI=1)混合，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中按照最佳吸附時間孵育6 min。將混合物4℃、8 000×g離心10 min，用LB液體培養(yǎng)基洗滌2次后，將沉積物重懸于等體積的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)，分別于0、10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210、240 min取樣。采用雙層瓊脂平板法檢測樣品中噬菌體滴度。上述實驗重復3次。參照文獻[35]計算噬菌體的暴發(fā)量(burst size)，如公式(1)所示。
暴發(fā)量(PFU/cell)=暴發(fā)期結束時游離的噬菌體數(shù)/潛伏期開始時感染的細菌細胞數(shù)(1)
1.9噬菌體的理化穩(wěn)定性
1.9.1酸堿敏感性檢測
取Yen-yong1懸液(2.00×109 PFU/mL)分裝成1 mL/管，用NaOH或HCl分別將其調(diào)至pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0，于37℃孵育2 h后取樣。
1.9.2鹽度敏感性檢測
分別配制NaCl質(zhì)量分數(shù)為0、1%、3%、5%、7%和9%的LB固體培養(yǎng)基和LB半固體培養(yǎng)基。分別取4 mL各鹽濃度的半固體LB培養(yǎng)基與100μL Yen-yong1懸液(4.47×108 PFU/mL)、200μL對數(shù)期CICC 10869(2.23×107 CFU/mL)菌液充分混合后，立即傾倒至相應鹽濃度的LB固體培養(yǎng)基上，冷卻后倒置于培養(yǎng)箱(37℃)中培養(yǎng)12 h后進行噬菌斑計數(shù)，計算噬菌體滴度。
1.9.3溫度敏感性檢測
取Yen-yong1懸液(3.70×109 PFU/mL)分裝成1 mL/管，分別置于-80、0、25、40、50、60、70和80℃孵育，分別于0、30、60、90和120 min取樣。
1.9.4噬菌體長期保存條件檢測
取新鮮培養(yǎng)的充分裂解的噬菌體-菌裂解液(2.63×109 PFU/mL)分裝成1 mL/管，分別于-80、-20、25(室溫)和4℃存放，用于檢測溫度對噬菌體活性的影響。在0-360 d中每隔30 d取樣檢測噬菌體滴度，每次每樣取3個平行管。在該種操作下，每個存于-80℃和-20℃的樣品均只凍融1次。
為了檢測多次凍融是否影響噬菌體滴度，取新鮮培養(yǎng)的充分裂解的噬菌體-菌裂解液(2.63×109 PFU/mL)裝于50 mL無菌EP離心管中(40 mL/管)，分別存放于-80℃和-20℃，用于檢測在該溫度下凍存次數(shù)對噬菌體活性的影響。在0-360 d中每隔30 d化凍、取樣檢測噬菌體滴度，每次每樣取3個平行管。
采用雙層瓊脂平板法測定樣品的噬菌體滴度。每個實驗重復3次。
1.10噬菌體對細菌生物被膜的清除能力
1.10.1細菌生物被膜形成能力檢測
采用結晶紫染色法[36]測定易感細菌的生物被膜形成能力。分別將易感菌株接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min培養(yǎng)16 h。取100μL培養(yǎng)液加入到10 mL LB液體培養(yǎng)基中進行稀釋。實驗組分別取500μL稀釋菌液加入到48孔細胞培養(yǎng)板中，對照組則加入500μL LB液體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h。然后用槍頭吸去培養(yǎng)孔中的液體，用0.01 mol/L PBS洗滌培養(yǎng)孔3次。在每個培養(yǎng)孔中加入500μL甲醇固定30 min，棄去甲醇并在室溫下干燥；在每個培養(yǎng)孔中加入500μL質(zhì)量分數(shù)為1%的結晶紫于室溫下對生物被膜染色30 min，用無菌水(ddH2O)洗滌培養(yǎng)孔3次，在室溫下干燥。隨后向每孔加入500μL體積分數(shù)為33%的冰醋酸。使用酶標儀測定OD590值。上述實驗重復3次。
細菌生物被膜形成能力判定標準分為強(4×ODc≤ODt)、中等(2×ODc<ODt≤4×ODc)、弱(ODc<ODt≤2×ODc)和無生物被膜形成(ODt≤ODc)這4個水平。其中，ODc和ODt分別為對照組和實驗組的OD590值。
1.10.2噬菌體對細菌生物被膜的清除能力
參照文獻[36]測定噬菌體對細菌生物被膜的清除能力。按照細菌生物被膜形成能力檢測方法(1.10.1節(jié))培養(yǎng)各易感細菌的生物被膜，實驗組每孔加入500μL噬菌體Yen-yong1懸液(1.85×109 PFU/mL)，對照組加入等體積的LB，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。然后按照1.10.1節(jié)的步驟進行結晶紫染色和OD590測定。上述實驗重復3次。
1.11噬菌體對生豬肉中病原菌的控制
為檢測Yen-yong1對生豬肉中污染的小腸結腸炎耶爾森氏菌的去除效果，分別在25℃和4℃下進行了細菌清除實驗。
從市場購買新鮮生豬肉500 g，用75%乙醇浸泡1 min以消毒表面。在超凈工作臺中取出并晾干后，用無菌解剖刀切除表層，切成大小均一的肉片(1 cm×1 cm×0.5 cm)，置于帶蓋無菌培養(yǎng)皿中。取新鮮培養(yǎng)的對數(shù)期小腸結腸炎耶爾森氏菌菌液，均勻滴加于生豬肉片表面(20μL/片，2×107 CFU/mL)，隨機將其分成兩組。實驗組分別按照不同MOI(MOI=1、10、100)均勻滴加噬菌體Yen-yong1懸液(20μL/片，2×107、2×108、2×109 PFU/mL)，對照組均勻滴加20μL LB液體培養(yǎng)基。再次將實驗組與對照組均分為兩組，分別置于室溫(25℃)和冷藏室(4℃)，以模擬豬肉在市場銷售和貯運的條件。對室溫放置的豬肉片分別于0 h和3 h取樣；對冷藏的豬肉片分別于0 h和24 h取樣。由于屠宰的生豬通常為冷藏運輸、儲存和出售，只有部分菜場會將少量豬肉置于常溫短期擺放，因此4℃下的實驗取樣時長為24 h，而25℃下為3 h。將取得的肉片樣品分別置于無菌EP管中，加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，研磨后采用標準平板計數(shù)法檢測細菌數(shù)量。每組設置3個平行。細菌清除率計算如公式(2)所示。
細菌清除率=(對照組小腸結腸炎耶爾森氏菌平均濃度-實驗組小腸結腸炎耶爾森氏菌平均濃度)/(對照組小腸結腸炎耶爾森氏菌平均濃度)×100%(2)
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