研究簡介
抗生素抗性進化是全球公共衛(wèi)生的重大威脅之一，下一代測序表明，適應抗生素的細菌種群通常包含具有不同耐藥性決定因素的多個克隆。盡管它們在主要選擇性條件下的適應性可能相當，但這些替代方案在其他相關條件下可能表現出不同的負債和優(yōu)勢。本研究通過定向進化實驗，探討了碳青霉烯酶Klebsiella pneumoniae carbapenemase-2（KPC-2）在適應性進化過程中如何迅速積累隱秘的表型變異。研究者利用定向進化方法，研究了KPC-2在適應性進化過程中對CAZ的抗性進化路徑多樣性。研究人員將野生型blaKPC-2基因克隆到高拷貝質粒中，并通過易錯PCR創(chuàng)建了約103至10?個突變體庫。通過在不同濃度的CAZ中篩選，研究者選擇了具有CAZ抗性的突變體，并對其進行了多輪突變和篩選。通過Sanger測序確定了突變體的基因型，并通過最小抑制濃度（MIC）測試評估了其表型。此外研究者還測量了酶的催化效率、細胞內穩(wěn)定性和生長速率等分子性狀。研究發(fā)現KPC-2可以通過多種不同的突變路徑進化出對頭孢他啶（ceftazidime,CAZ）的高活性，這些路徑在分子水平（如催化效率和細胞內穩(wěn)定性）和宏觀水平（如生長速率和其他β-內酰胺類抗生素的活性）上表現出顯著差異。盡管這些突變路徑在最終的CAZ抗性上表現出相似性，但在其他性狀上的差異表明，即使在強選擇壓力下，進化路徑和結果也可能因初始突變的不同而迅速分化。這些發(fā)現對于理解抗生素抗性進化的復雜性以及設計有效的抗性管理策略具有重要意義。
Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀的應用
Bioscreen C Pro生長曲線分析儀被用于測量KPC-2及其突變體在不同條件下的生長速率。研究人員將E.coli TOP10菌株（表達KPC-2及其突變體）接種到含有8μg/ml CAZ或50μg/ml卡那霉素的LB肉湯中，使用Bioscreen生長曲線分析儀在37°C下培養(yǎng)20小時。每隔10分鐘測量一次600 nm處的吸光度（OD600），以評估菌株的生長情況。通過生長曲線分析，研究者能夠確定不同突變體在CAZ存在和不存在條件下的生長速率差異。這些數據對于理解突變體在不同環(huán)境下的適應性具有重要意義，尤其是在評估抗生素抗性進化過程中潛在的適應性成本方面。
實驗結果
研究發(fā)現KPC-2可以通過至少四種不同的初始突變進化出對CAZ的高活性，這些突變在不同路徑中表現出顯著的表型差異。盡管在CAZ抗性上表現出相似性，但在其他性狀上（如催化效率、細胞內穩(wěn)定性和生長速率）表現出顯著差異。此外，研究還發(fā)現，即使在CAZ MICs穩(wěn)定后，突變路徑仍在繼續(xù)進化，表現為細胞內穩(wěn)定性和生長速率的進一步優(yōu)化。本研究揭示了KPC-2在適應性進化過程中對CAZ的抗性進化路徑多樣性。研究結果表明，即使在強選擇壓力下，進化路徑和結果也可能因初始突變的不同而迅速分化。這些發(fā)現對于理解抗生素抗性進化的復雜性以及設計有效的抗性管理策略具有重要意義。
圖1、KPC-2定向進化過程中恢復的突變途徑，以增加CAZ耐藥性。a，在第1輪分離的最初22個菌落中檢索到的9個獨特KPC-2變體的豐度。根據先前顯示與CAZ抗性相關的四個位置之一的氨基酸取代位置，它們被分為四類（如顏色差異所示）。加號表示編碼KPC-2的基因中存在其他輔助突變（補充表1）。較深的陰影表示重復的總豐度，而較淺的陰影表示獨立的出現。b，跨輪次同義突變的比例（帶圓圈的黑實線;深灰色陰影代表后面的輪次）。輔助y軸顯示同義（藍色虛線）和非同義突變（紅色虛線）的總數。c，跨輪和譜系的CAZ抗性軌跡的多樣性，分組和著色。d，所研究的18個譜系的水平排列，僅突出顯示有變化的位置。譜系的排列、分組和顏色如a所示，較深的陰影代表較晚的輪次。
圖2、在向CAZ抗性進化過程中，四種關鍵有益突變的所有組合的適應性景觀。a）從祖先KPC-2（底部節(jié)點）開始的不同突變軌跡的可及性示意圖。b）自適應景觀的側視圖，顏色和節(jié)點大小約定與圖a相同。在合并一個或兩個突變后，耐藥性迅速趨于穩(wěn)定，通過編碼取代H274Y和V240A的突變組合達到全局適應性峰值。c）個體適應度效應的分布（以CAZ易感性的變化來衡量），表明大多數突變在各個背景中都是中性的或有害的，盡管它們對祖先都是有益的——突出了上位性在該系統(tǒng)中的強度和普遍性。d）在景觀中觀察到的不同類型的成對上位性的例子。e）上位性類型在整個景觀中的分布。
圖3、在CAZ抗性演化過程中，對其他β-內酰胺類的側支敏感性迅速分化。a）針對每個譜系在幾輪中累積的非同義突變數量的抗性軌跡。顏色表示基于與CAZ抗性相關的位置的分組，其中藍色、綠色、黃色和紅色分別代表D179Y、H274Y、L169P和S171P。b）跨輪的阻力模式。左上角面板顯示每種β-內酰胺類藥物的絕對變化（即效應大小）。c）譜系之間和譜系內側支敏感性的變化。d）沿突變途徑的側支敏感性差異。
圖4、平臺期內連續(xù)突變體的生長率。（a）光密度（OD）在生長的12小時內發(fā)生變化。黑線代表野生型KPC-2菌株，灰線代表早期平臺菌株，彩色線代表后續(xù)菌株。（b）總結上述增長曲線的最大增長率的箱線圖。X軸標簽（不包括對照菌株）由指示進化線的底部標簽（如表S2所示）和指示分離株取自哪一輪的頂部標簽組成.
圖5、在沒有抗生素的情況下沿進化軌跡的生長率。（a）光密度在生長的12小時內發(fā)生變化。黑線代表野生型KPC-2菌株，粗彩色線代表第一輪菌株，較細的彩色線代表平臺菌株。（b）總結上述增長曲線的最大增長率的箱線圖。（c）在沒有抗生素的情況下的生長率與存在亞抑制濃度CAZ的情況下測得的生長率呈中等負相關，盡管不顯著。
總結
有益突變（即上位性）之間的相互作用通常足夠強，可以通過替代突變途徑引導適應。盡管替代解決方案在主要選擇條件下應表現出相似的適應性，但它們在次級環(huán)境中的特性可能存在很大差異。盡管這些神秘差異很重要，但這些隱秘差異在多大程度上是未知的——例如，在識別賦予抗生素耐藥性的突變中可利用的附帶敏感性方面。研究人員使用定向進化來表征突變途徑的多樣性，通過這些途徑，流行的碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶-2可以進化出針對臨床相關抗生素頭孢他啶（最初較差的底物）的高活性。本研究確定了40種不同的替換——包括許多在臨床環(huán)境中常見的——分布在18種不同的突變軌跡中。最初的突變確定了軌跡可以分為四個主要組，這是強上位性的特征。盡管最終頭孢他啶耐藥性相似，但各組在多個表型維度上存在顯著差異，從分子性狀（例如細胞內穩(wěn)定性和催化效率）到宏觀性狀（例如生長速率和對其他β-內酰胺類抗生素的活性）。Bioscreen C Pro生長曲線分析儀被用于測量KPC-2及其突變體在不同條件下的生長速率，通過生長曲線分析，研究者能夠確定不同突變體在CAZ存在和不存在條件下的生長速率差異。這些數據對于理解突變體在不同環(huán)境下的適應性具有重要意義，尤其是在評估抗生素抗性進化過程中潛在的適應性成本方面。本研究結果對于理解抗生素抗性進化的復雜性以及設計有效的抗性管理策略具有重要意義。
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