2.4 mogR的缺失對(duì)Lm低溫生長(zhǎng)的影響(growth curve)
本研究分別在4、28、37℃條件下培養(yǎng)菌株ATCC 19115、ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA，測(cè)定菌液OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線(圖9)，計(jì)算曲線下面積(area under the curve,AUC)(圖10A–10C)和曲線下面積差異(ΔAUC)(圖10D)，以分析鞭毛的產(chǎn)生對(duì)Lm低溫生長(zhǎng)的影響。
結(jié)果顯示，在4℃時(shí)，與親本株ATCC 19115相比，缺失株ΔmogR(圖9A)和回補(bǔ)株cΔflaA(圖9B)的生長(zhǎng)能力下降，其AUC值分別為13.2和13.5(圖10A)，比親本株的AUC值(14.6)低9.84%和8.07%(P<0.05)(圖10D)；回補(bǔ)株cΔmogR(圖9A)和缺失株ΔflaA(圖9B)在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期的生長(zhǎng)均高于親本株，其AUC值分別為16.6和20.7(圖10A)，比親本株的AUC值(14.6)高13.67%和41.22%(P<0.01)(圖10D)。在28℃時(shí)，5個(gè)菌株的生長(zhǎng)無顯著性差異(圖9C、圖10B和10D)。5個(gè)菌株在37℃時(shí)的情況與4℃時(shí)的相似(圖9D、圖10C和10D)。結(jié)果表明，4℃時(shí)MogR對(duì)鞭毛合成的抑制作用有助于Lm低溫生長(zhǎng)。
圖8ΔmogR和cΔmogR的鞭毛基因fliN、flhB、flgE、fliM、flgK、fliF和fliI在4℃(A)、28℃(B)和37℃(C)條件下相比于親本株ATCC 19115的相對(duì)轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平
圖9 ATCC 19115、ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA在4℃(A和B)、28℃(C)和37℃(D)條件下的生長(zhǎng)曲線
圖10 ATCC 19115、ΔmogR、cΔmogR、ΔflaA和cΔflaA在4℃(A)、28℃(B)和37℃(C)條件下的生長(zhǎng)曲線的曲線下面積值和與親本株相比的曲線下面積差異ΔAUC(D)
3討論
3.1低溫下Lm的運(yùn)動(dòng)能力和鞭毛表達(dá)量不具有血清型特異性
Lm有14個(gè)血清型：1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、7[16]和4h[17]，其中1/2a、1/2b、1/2c和4b是食品和臨床病例中最常分離到的血清型，約占所有血清型的95%[18-19]。本研究選取來自這4個(gè)血清型的菌株ATCC 19115(4b)、ATCC 19111(1/2a)、YSP2019032612(1/2b)和Lm210722566(1/2c)，通過運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)和RT-qPCR測(cè)定了菌株在4、28、37℃生長(zhǎng)時(shí)的運(yùn)動(dòng)能力和鞭毛基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)所有菌株4℃時(shí)的結(jié)果均顯著低于28℃時(shí)的結(jié)果(P<0.01或P<0.001)，且所有菌株37℃時(shí)的結(jié)果與4℃時(shí)的相似(圖11、圖12)，表明低溫4℃時(shí)Lm鞭毛表達(dá)低是非血清型特異性的，因此本研究選擇Lm ATCC 19115(4b)菌株為親本株進(jìn)行了深入的研究。
3.2 MogR的抑制蛋白GmaR在鞭毛基因表達(dá)中發(fā)揮作用
Lm在20?30℃條件下，MogR被抗阻遏蛋白GmaR抑制，MogR對(duì)鞭毛基因表達(dá)的抑制被解除，Lm產(chǎn)生鞭毛[7,10,20]。GmaR是溫度感應(yīng)蛋白，在37℃時(shí)，GmaR單體蛋白凝集在一起，無法與MogR結(jié)合，不能發(fā)揮抗阻遏作用，導(dǎo)致MogR抑制鞭毛基因表達(dá)；在30℃時(shí)，GmaR單體蛋白與MogR結(jié)合，使MogR離開鞭毛基因啟動(dòng)子，從而使鞭毛基因得以表達(dá)[11]。本研究結(jié)果表明4℃時(shí)MogR抑制了Lm鞭毛的形成，說明MogR未被GmaR抑制。那么4℃時(shí)GmaR是否如同在37℃時(shí)一樣處于單體聚集狀態(tài)，不與MogR結(jié)合，不發(fā)揮抗MogR阻遏作用，使MogR發(fā)揮抑制鞭毛基因表達(dá)的功能？我們正在進(jìn)行這方面的探究。
3.3 MogR對(duì)Lm鞭毛基因表達(dá)的抑制作用與DegU相關(guān)
Lm在20?30℃條件下能形成鞭毛，除了GmaR發(fā)揮對(duì)MogR的抑制作用外，還需要雙組分系統(tǒng)(HK/RR)中的孤兒RR DegU的正調(diào)控作用。DegU結(jié)合到fliN-gmaR操縱元(即operon 394)的啟動(dòng)子區(qū)域以調(diào)控gmaR的表達(dá)(圖1)，DegU的結(jié)合位點(diǎn)不與MogR的結(jié)合位點(diǎn)重疊，而且能以非磷酸化形式起作用[7,20-21]。本研究結(jié)果表明低溫4℃時(shí)MogR對(duì)Lm的鞭毛基因表達(dá)有抑制作用，說明GmaR未阻遏MogR的作用。那么是否表明，低溫4℃時(shí)gmaR的表達(dá)未受到DegU的正調(diào)控，gmaR沒有表達(dá)出GmaR蛋白而無法行使對(duì)MogR的阻遏作用？這還有待進(jìn)一步探究。
圖11 Lm菌株ATCC 19115、ATCC 19111、YSP2019032612和Lm210722566分別在4、28、37℃下的運(yùn)動(dòng)能力(A)及運(yùn)動(dòng)圈的直徑大小(B)
圖12與28℃相比，4℃和37℃條件下Lm菌株ATCC 19115、ATCC 19111、YSP2019032612和Lm210722566的鞭毛絲蛋白基因flaA的相對(duì)表達(dá)量
3.4鞭毛的產(chǎn)生與Lm低溫生長(zhǎng)的關(guān)系
研究發(fā)現(xiàn)，在冷藏溫度4?8℃時(shí)，Lm下調(diào)鞭毛基因表達(dá)量以降低其運(yùn)動(dòng)性來維持生長(zhǎng)，生長(zhǎng)快的菌株的鞭毛基因表達(dá)量顯著低于生長(zhǎng)慢的菌株，且隨著時(shí)間的推移，生長(zhǎng)慢的菌株運(yùn)動(dòng)性會(huì)更強(qiáng)，但未闡明具體機(jī)制[5-6]。本研究結(jié)果顯示，在4℃時(shí)，mogR缺失后，Lm的鞭毛基因轉(zhuǎn)錄不被抑制，鞭毛基因表達(dá)量顯著高于親本株(圖7、圖8)，鞭毛合成量顯著多于親本株(圖5、圖6)，運(yùn)動(dòng)性顯著強(qiáng)于親本株(圖4)，生長(zhǎng)能力顯著弱于親本株(圖9、圖10)，表明鞭毛的產(chǎn)生會(huì)降低Lm在4℃時(shí)的生長(zhǎng)速率。
4結(jié)論
本研究構(gòu)建了Lm鞭毛基因轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白MogR和鞭毛絲蛋白FlaA的缺失株ΔmogR和ΔflaA，以及相應(yīng)的回補(bǔ)株cΔmogR和cΔflaA，測(cè)定了菌株分別在4、28、37℃時(shí)的運(yùn)動(dòng)性、鞭毛產(chǎn)生情況和鞭毛基因表達(dá)量，結(jié)果表明Lm在4℃時(shí)鞭毛產(chǎn)量少與MogR的抑制作用有關(guān)；本研究測(cè)定了菌株分別在4、28、37℃時(shí)的生長(zhǎng)曲線，通過分析發(fā)現(xiàn)，在低溫條件下Lm能生長(zhǎng)繁殖與MogR對(duì)鞭毛基因表達(dá)的抑制作用有關(guān)。本研究為揭示Lm低溫生長(zhǎng)機(jī)制提供了新的信息。
基于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀研究單增李斯特菌低溫生長(zhǎng)機(jī)制（一）
基于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀研究單增李斯特菌低溫生長(zhǎng)機(jī)制（二）
基于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀研究單增李斯特菌低溫生長(zhǎng)機(jī)制（三）
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