摘要：
牛支原體（Mycoplasma bovis,M.bovis）是支原體屬中致病性較強(qiáng)的物種之一，可引起牛以肺炎為主的多種亞急性或慢性傳染病，嚴(yán)重阻礙全球養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展。本研究從廣東陽江患嚴(yán)重肺炎的病死牛肺臟中成功分離出一株牛支原體（編號(hào)YJ-22）。通過菌落形態(tài)觀察、特異性PCR（靶標(biāo)P48基因，片段約526 bp）及測(cè)序比對(duì)（同源性>99.3%）、生化鑒定（符合牛支原體特征：不能利用葡萄糖、精氨酸、明膠、尿素、甘露醇，可利用乳糖）確認(rèn)其種屬。繪制該分離株的生長曲線顯示，其在PPLO培養(yǎng)基中于18至45小時(shí)活菌數(shù)維持在1×10?~1×10?CCU/mL。致病性試驗(yàn)表明，通過氣管注射10 mL 1×101?CCU/mL菌液連續(xù)攻毒3天，可使2~3月齡斷奶犢牛出現(xiàn)典型臨床癥狀（發(fā)熱、咳嗽、喘氣、鼻腔黏液增多）和肺部典型病變（肉眼可見肉變、出血，肺部病變?cè)u(píng)分9分和11分，組織學(xué)可見肺結(jié)構(gòu)破壞、炎癥浸潤、增生）。鼻拭子排菌檢測(cè)呈陽性。利用BEI滅活的YJ-22菌體制備滅活疫苗免疫兔子，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性IgG抗體（效價(jià)≥1:64），表明其具有免疫原性。但體外殺菌試驗(yàn)顯示，該陽性兔血清對(duì)YJ-22的生長無抑制效應(yīng)（存活率100%）。本研究為M.bovis的高密度培養(yǎng)、致病機(jī)制研究及疫苗（特別是以兔子為模型篩選疫苗株或抗原）研發(fā)提供了重要基礎(chǔ)。
引言
牛支原體（Mycoplasma bovis,M.bovis）被認(rèn)為是支原體屬支原體科中致病性較強(qiáng)的物種之一。M.bovis可引起以肺炎為主的亞急性或慢性傳染病，還能導(dǎo)致多種其他癥狀，包括關(guān)節(jié)炎、乳腺炎、結(jié)膜炎、耳炎和妊娠母牛流產(chǎn)等。此外，M.bovis可引起無癥狀感染，并長期定殖于鼻腔。該病原于1960年代在美國感染牛乳腺炎的病例中首次被檢測(cè)出，此后在全球大多數(shù)國家均有報(bào)道。我國于1983年首次從患乳腺炎的病牛中分離到M.bovis，2008年相繼報(bào)道從肉牛和犢牛肺臟中分離到該病原。目前，全國各地均有M.bovis肺炎疫情的報(bào)道。自首次報(bào)道以來，M.bovis肺炎已嚴(yán)重阻礙了全球養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展。
支原體是最小的自我復(fù)制的原核生物，直徑為0.2~0.3μm，基因組較?。?00~2500 kb環(huán)狀雙股DNA），僅含有500~1000個(gè)基因。由于其遺傳信息有限，支原體缺乏許多酶活性和代謝途徑，導(dǎo)致其營養(yǎng)需求復(fù)雜，高度依賴宿主，在體外難以實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)，M.bovis亦不例外。為此，我們對(duì)新分離的M.bovis進(jìn)行了生長特性研究，以期為其高密度培養(yǎng)提供依據(jù)。
支原體缺乏細(xì)胞壁，因此對(duì)許多靶向細(xì)胞壁合成的抗生素（如β-內(nèi)酰胺類、糖肽類如桿菌肽）不敏感。它對(duì)多粘菌素、磺胺類、第一代喹諾酮類藥物和甲氧芐啶等也具有天然抗性。此外，支原體也容易對(duì)其他抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，研制預(yù)防牛支原體肺炎的疫苗迫在眉睫。目前市場上尚無商品化的M.bovis疫苗，這與其缺乏能穩(wěn)定復(fù)現(xiàn)疾病的理想動(dòng)物攻毒模型密切相關(guān)。本研究在分離鑒定的基礎(chǔ)上，分析了新分離株YJ-22對(duì)犢牛的致病性，并使用兔子模型初步驗(yàn)證了其免疫原性，以期為M.bovis疫苗的研制提供基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1病料來源
采集自廣東陽江某牛場患嚴(yán)重肺炎的病死牛肺臟組織。病牛臨床主要表現(xiàn)為咳嗽、有濃鼻液、消瘦等。
1.2主要試劑
PPLO培養(yǎng)基購自美國BD公司；馬血清購自美國Cytiva公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司；2×Taq PCR MasterMix購自北京索萊寶科技有限公司。
1.3病料處理
無菌條件下將采集的肺組織切成小塊，取約1 g肺組織加入2 mL含雙抗（青霉素、鏈霉素）的PBS，研磨后6000×g離心10 min，收集上清液，用0.45μm濾膜過濾后備用。
1.4病原分離與純化
將1.3處理好的肺臟上清液接種到PPLO液體培養(yǎng)基中（含20%馬血清），置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔48 h觀察顏色變化并傳代。取培養(yǎng)基顏色由紅變黃且保持澄清者，傳至3代后，取變黃的培養(yǎng)物涂布于PPLO固體培養(yǎng)基（含20%馬血清）中。3~5 d后，肉眼觀察菌落生長情況并在40-100X顯微鏡下觀察菌落形態(tài)，挑取典型的“煎蛋樣”（Fried-egg）菌落接種到PPLO液體培養(yǎng)基中。待生長后再次接種固體培養(yǎng)基，重復(fù)此“液體-固體”克隆純化過程3次，獲得純培養(yǎng)物。
1.5 PCR鑒定
參照已發(fā)表文獻(xiàn)，合成M.bovis特異性檢測(cè)引物MB-P48-F/MB-P48-R（委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成）。MB-P48-F：5'-CCTAAAAAGGGTGAATTAGCATCTT-3'；MB-P48-R：5'-CTGAGTTAATAGCAGCAACTGCAACG-3'。預(yù)期擴(kuò)增片段約526 bp。反應(yīng)體系（20μL）：2×Taq PCR MasterMix 10μL，上、下游引物（10μM）各0.5μL，模板2μL，ddH?O 7μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。
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