2結(jié)果與分析
2.1 APP鑒定及血清型分型
將臨床分離到的疑似APP菌株，用APP特異性基因apxIV片段的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定出APP菌株共53株。采用針對(duì)APP 1~15血清型特異性基因的引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，結(jié)果顯示，本研究鑒定出APP菌株血清型1型25株（959 bp）、7型20株（601 bp）、5型3株（825 bp）、15型4株（1 595 bp）和8型1株（1 157 bp）（圖1A）。對(duì)菌株來源分析發(fā)現(xiàn)，本研究鑒定的53株臨床主要來自于江西、云南及甘肅等地區(qū)（圖1B），江西地區(qū)以7型為主、云南甘肅都以1型為主，3株血清型5型來源于江西和云南，4株血清型15型來源于甘肅、江西和陜西。所有菌株血清型以1型和7型為主，5型和15型次之，8型相對(duì)較少。
圖1菌株P(guān)CR鑒定及分型
A：血清分型鑒定；B：菌株來源分布及血清型分型情況。
2.2菌株生物學(xué)特性檢測(cè)
2.2.1生長曲線和溶血活性測(cè)定
為測(cè)定臨床APP菌株各個(gè)血清型生長趨勢(shì)及規(guī)律，本研究通過測(cè)定細(xì)菌不同時(shí)間的OD600nm值，繪制生長曲線。如圖2A所示，各血清型菌株均能在培養(yǎng)基中生長良好。在2~4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)中期，10~12 h為衰亡期。其中1型菌株OD600nm最高值能達(dá)到0.5~0.8；5型菌株OD600nm最高值能達(dá)到0.3~0.4；7型菌株OD600nm最高值能達(dá)到0.4~0.6；15型菌株OD600nm最高值能達(dá)到1~1.2，15型菌株生長速度較其他血清型更快。
圖2菌株生物學(xué)特性檢測(cè)
A：不同血清型菌株生長曲線測(cè)定；B：菌株溶血環(huán)直徑；C：菌株溶血環(huán)。
本研究也對(duì)不同血清型菌株的溶血活性進(jìn)行了測(cè)定。如圖2C所示，不同血清型菌株均能在綿羊血培養(yǎng)基中出現(xiàn)透光的溶血環(huán)，但溶血活性不同：1型菌株溶血環(huán)（2.726 mm±0.516 mm）和5型菌株溶血環(huán)（3.427 mm±0.350 mm）直徑較大；7型菌株（1.316 mm±0.314 mm）和15型菌株（1.337 mm±0.363 mm）溶血環(huán)直徑較?。▓D2B和圖2C）。這與前期報(bào)道一致，4種血清型菌株均含有溶血活性的毒素ApxII，而1型、5型菌株含有溶血活性更強(qiáng)的毒素ApxI，因此能形成更大的溶血環(huán)。
2.2.2耐藥性情況檢測(cè)
根據(jù)2020版美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）中的標(biāo)準(zhǔn)，采用流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)對(duì)MIC結(jié)果進(jìn)行分析，其中多西環(huán)素參考四環(huán)素類藥物標(biāo)準(zhǔn)（MIC≤2μg/mL為敏感，MIC≥8μg/mL為耐藥）、氟苯尼考參考氯霉素標(biāo)準(zhǔn)（MIC≤2μg/mL為敏感，MIC≥8μg/mL為耐藥）。結(jié)果如表3所示，所有血清型對(duì)多西環(huán)素均較為敏感，但是7型菌株中有10%為耐藥菌株。對(duì)于氟苯尼考，1型臨床分離株對(duì)敏感性普遍較低，耐藥率高達(dá)88%，5型和15型對(duì)氟苯尼考較為敏感，而7型存在40%的耐藥菌株。本研究也對(duì)沒有參考標(biāo)準(zhǔn)的抗生素按MIC≤2μg/mL為敏感，MIC≥8μg/mL為耐藥進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)對(duì)于磺胺二甲嘧啶和泰樂菌素，臨床分離菌株均不敏感。對(duì)于鹽酸克林霉素和慶大霉素，臨床分離株均較敏感。而值得注意的是，對(duì)于恩諾沙星、青霉素和頭孢噻呋的敏感性最高。
表3分離菌株對(duì)抗生素的耐藥結(jié)果
2.2.3大蠟螟初篩疫苗候選菌株
為了篩選高毒力菌株，本研究首先利用大蠟螟幼蟲作為動(dòng)物模型進(jìn)行初步篩選。通過2輪感染實(shí)驗(yàn)后，排除2次結(jié)果誤差較大的菌株，選擇死亡率大于50%且感染劑量低的菌株作為候選菌株。如圖3A所示，本研究選擇1型菌株（命名為1-4、3-7、6-8）和7型菌株（命名為2-6、4-10）進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。由于菌株數(shù)量較少，5型（命名為4-3、4-9、7-2）和15型（命名為1-5、5-5、5-11、6-9）直接進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。
圖3高毒力菌株篩選
A：大蠟螟模型初篩血清1型和7型高毒力菌株；B：各血清型菌株對(duì)小鼠的存活率。
2.2.4小鼠篩選高毒力疫苗候選菌株
小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示，血清型1型菌株3-7、5型菌株4-3、7型菌株2-6、15型菌株1-5對(duì)小鼠的致死率較高，分別為83.33%、66.67%、100%和100%，選為高毒力疫苗候選菌株用于后續(xù)試驗(yàn)。
2.3疫苗候選菌株免疫效果評(píng)價(jià)
2.3.1疫苗候選菌株LD50測(cè)定
測(cè)定疫苗候選菌株LD50，為后續(xù)的疫苗免疫和攻毒試驗(yàn)劑量的提供參考。利用改良寇氏計(jì)算法得出血清型1型、5型、7型和15型菌株對(duì)Balb/c小鼠的LD50分別為2×106、1×107、6.3×107和2×108 CFU。
2.3.2疫苗抗體水平檢測(cè)及保護(hù)率測(cè)定
制備篩選獲得臨床分離株的滅活疫苗，以商品化疫苗作為對(duì)照對(duì)小鼠進(jìn)行免疫。對(duì)于血清型1型菌株，臨床分離株免疫劑量不到商品化疫苗中1型菌株的1/5，保護(hù)效果卻與商品化疫苗一致，均達(dá)到100%，且二免后誘導(dǎo)抗體水平相似，表明該1型分離株具有疫苗開發(fā)潛力（圖4A）。對(duì)于血清型5型臨床菌株，免疫劑量不到商品化疫苗中5型菌株的1/5，二免后誘導(dǎo)抗體水平與商品化疫苗相似，但攻毒后小鼠存活率（83.3%）低于商品化疫苗免疫組（100%）（圖4B）。對(duì)于血清型7型臨床菌株，免疫劑量約為商品化疫苗中7型菌株的10倍，二免后誘導(dǎo)抗體水平顯著高于商品化疫苗，但攻毒后小鼠存活率（50%）低于商品化疫苗免疫組（66.7%）（圖4C）。如圖4D所示，商品化疫苗中沒有15型菌株，二免后商品化疫苗仍然能夠誘導(dǎo)一定的15型菌株抗體，但其抗體水平顯著低于臨床菌株，攻毒后，臨床菌株組小鼠存活率（66.7%）高于商品化疫苗免疫組（50%）（圖4D）。
圖4單價(jià)滅活疫苗免疫效果評(píng)價(jià)
A：1型單價(jià)疫苗組抗體水平測(cè)定及保護(hù)率評(píng)價(jià)；B：5型單價(jià)疫苗組抗體水平測(cè)定及保護(hù)率評(píng)價(jià)；C：7型抗體水平測(cè)定及保護(hù)率評(píng)價(jià)；D：15型單價(jià)疫苗組抗體水平測(cè)定及保護(hù)率評(píng)價(jià)。
2.3.3疫苗候選菌株穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
為了研究疫苗候選菌株的穩(wěn)定性，本研究將菌株在體外連續(xù)傳代30次后，分別選取候選菌株的10代、20代、30代菌株以致死劑量感染小鼠，每組6只，觀察小鼠存活情況。結(jié)果顯示，血清型1型菌株攻毒后，0代、10代、20代和30代菌株對(duì)小鼠的致死率分別為100%、100%、100%和50%。血清型5型菌株攻毒后，0代、10代、20代和30代菌株對(duì)小鼠的致死率分別為50%、83.3%、50%和50%。血清型7型菌株攻毒后，0代、10代、20代和30代菌株對(duì)小鼠的致死率分別為100%、100%、100%和50%。血清型15型菌株攻毒后，0代、10代、20代和30代菌株對(duì)小鼠的致死率分別為83.3%、50%、83.3%和50%（圖5）。結(jié)果可見，所有菌株在傳代20代內(nèi)都表現(xiàn)出較高毒力。
圖5候選菌株傳代穩(wěn)定性測(cè)試
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