2結(jié)果


2.1Rv2029c基因擴(kuò)增結(jié)果


以提取的結(jié)核基因組為模板，在設(shè)計(jì)好的引物作用下，行PCR擴(kuò)增。PCR成功擴(kuò)出Rv2029c DNA，大小1 020 bp。見圖1。

注：1為基因Rv2029c；M為DNA2000標(biāo)記物

圖1結(jié)核DosR基因Rv2029c PCR結(jié)果


2.2pET30a-Rv2029c重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定


將挑取的單克隆菌用EcoRⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，酶切鑒定發(fā)現(xiàn)，陽性重組質(zhì)粒能切出2條基因片段，分別為質(zhì)粒pET30a(5 422 bp)和插入的目的基因Rv2029c(1 020 bp)。與連接片段大小吻合，可初步認(rèn)為pET30a-Rv2029c構(gòu)建成功。見圖2。

注：M為DNA標(biāo)記物；1～2為陰性質(zhì)粒；3為陽性質(zhì)粒pET30a-Rv2029c

圖2 pET30a-Rv2029c重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果


2.3基因測序結(jié)果和GenBank序列


比對(duì)將酶切鑒定成功的重組質(zhì)粒送往南京金斯瑞公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank所給序列進(jìn)行Blast?；騌v2029c與GenBank中所給序列完全吻合，重復(fù)率100%，基因無突變。


2.4pET30a-Rv2029c促大腸埃希菌生長的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析


將3次測量獲得的資料進(jìn)行重復(fù)測量的方差分析，結(jié)果顯示sum值觀察時(shí)間效應(yīng)：不同時(shí)間OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8 351.248，P<0.05)，空質(zhì)粒組(pET30a)和重組質(zhì)粒組(pET30a-Rv2029c)不同時(shí)間OD值差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3 593.681、4 125.791，P<0.05)。sum值觀察處理因素效應(yīng),重組質(zhì)粒組(pET30a-Rv2029c)OD值高于空質(zhì)粒組(pET30a)(t=4 416.54，P<0.05)。從各時(shí)間點(diǎn)來看，0～5 h空質(zhì)粒組和重組質(zhì)粒組(pET30a-Rv2029c)OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.372、1.220、0.894、0.935、0.787、0.395，P>0.05)，6～15 h由于加入IPTG誘導(dǎo)了蛋白R(shí)v2029c的表達(dá)，OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；生長時(shí)間和處理因素存在交互效應(yīng)(F=767.049，P<0.05)。見表1。

表1 0～15 h導(dǎo)入Rv2029c對(duì)大腸埃希菌OD值的影響


組別生長時(shí)間(h)101112131415sumFP空質(zhì)粒組x0.605 0.608 0.616 0.610 0.608 0.618 0.411 3 593.6810.000 s0.018 0.007 0.010 0.011 0.014 0.011 0.272重組質(zhì)粒組x1.015 1.057 1.097 1.103 1.164 1.159 0.658 4 125.7910.000 s0.023 0.017 0.027 0.026 0.056 0.022 0.476 sumx0.809 0.832 0.856 0.856 0.885 0.889 0.534*8 351.248*0.000*s0.212 0.231 0.248 0.254 0.289 0.279 0.371*t42.664 70.736 49.077 51.358 28.815 66.182 4 416.540*P0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000*


2.5pET30a-Rv2029c促大腸埃希菌生長曲線


以生長時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制出大腸埃希菌生長曲線見圖3。在5 h時(shí)(此時(shí)OD值約為0.45)加入IPTG，空質(zhì)粒組(pET30a)大腸埃希菌在6 h進(jìn)入平臺(tái)期，而重組質(zhì)粒組(pET30a-Rv2029c)卻能繼續(xù)維持對(duì)數(shù)期達(dá)10 h左右，并且突破大腸埃希菌的生長界限，使大腸埃希菌的OD值達(dá)到1.16左右才進(jìn)入平臺(tái)期，若以O(shè)D值反映大腸埃希菌數(shù)量，則重組質(zhì)粒(pET30a-Rv2029c)能促使大腸埃希菌生長量提高1倍。

圖3蛋白R(shí)v2029c促大腸埃希菌生長曲線


3討論


本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入了重組質(zhì)粒pET30a-Rv2029c的大腸埃希菌與不導(dǎo)入該基因的大腸埃希菌相比，存在著某種機(jī)制使大腸埃希菌能夠在低氧、營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的環(huán)境下繼續(xù)維持在對(duì)數(shù)生長期，增強(qiáng)了大腸埃希菌抵抗應(yīng)激環(huán)境的能力，增加了大腸埃希菌的數(shù)量。Rv2029c蛋白在Mg2+和ATP的參與下催化6磷酸果糖形成2,6二磷酸果糖，因此在糖代謝中起著重要作用。含有重組質(zhì)粒pET30a-Rv2029c的大腸埃希菌可能通過Rv2029c蛋白，調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)的供給，提高了對(duì)抗低氧環(huán)境，增加了利用糖酵解的能力，與不含Rv2029c的大腸埃希菌相比突破了糖代謝和糖利用的上限，促進(jìn)了大腸埃希菌的生長。


結(jié)核分枝桿菌的肉芽腫環(huán)境同大腸埃希菌平臺(tái)期環(huán)境相似，都存在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏、低氧、代謝產(chǎn)物增加等對(duì)細(xì)菌生存不利的因素，依此推斷，結(jié)核分枝桿菌蛋白R(shí)v2029c可能在肉芽腫環(huán)境組織中起到重要的維持細(xì)菌存活的作用。結(jié)核分枝桿菌在潛伏期為適應(yīng)肉芽腫的微環(huán)境，一方面需要減少自身代謝活動(dòng)從而進(jìn)入休眠期，KUMAR等對(duì)DosR蛋白中的Rv0079(休眠相關(guān)翻譯抑制子DATIN)的研究證實(shí)了這一點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)此蛋白抑制了大腸埃希菌的生長，這是因?yàn)樵摰鞍着c核糖體30S亞基結(jié)合從而阻斷了蛋白合成中的翻譯過程，降低了細(xì)菌的繁殖速度，使其進(jìn)入休眠期。另一方面結(jié)核分枝桿菌可能需要最大限度利用環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣等滿足自身生存基本需要，本文研究的結(jié)果支持了這一點(diǎn)，生物信息學(xué)分析表明蛋白R(shí)v2029c為6-磷酸果糖激酶2，此蛋白屬于pfkB糖激酶超家族，是糖代謝的一種重要信號(hào)酶，通過影響2，6二磷酸果糖的水平實(shí)現(xiàn)對(duì)糖酵解通路的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了結(jié)核分枝桿菌在肉芽腫環(huán)境中最大程度利用氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的能力，維持結(jié)核分枝桿菌生存基本需求。進(jìn)一步研究該蛋白促進(jìn)細(xì)菌糖酵解的具體機(jī)制是下一步研究的方向。


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