嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila隸屬弧菌科、氣單胞菌屬，是一種革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛存在于淡水、污水、土壤及人體糞便中。魚感染該菌后鰓部、體表出血潰爛，內臟發(fā)白，可引起急性胃炎、腸炎等病癥，是一種典型“人-獸-魚”共患病原菌。近年來由嗜水氣單胞菌引發(fā)水生動物的病例不斷增多，是水生動物尤其是魚類最常見的致病菌。該菌嚴重威脅水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和人類健康。研究表明，選擇具有代表性的免疫原性好的嗜水氣單胞菌菌株，制備滅活疫苗，用于魚類浸泡或注射免疫，在魚類嗜水氣單胞菌病防控上取得了良好效果。在規(guī)模化生產菌體過程中，細菌的數量和致病力受溫度、鹽度、pH、碳源、氮源等培養(yǎng)條件的影響。本試驗通過研究不同培養(yǎng)條件下嗜水氣單胞菌的生長，優(yōu)化工業(yè)化生產嗜水氣單胞菌的培養(yǎng)條件，以期為嗜水氣單胞菌工業(yè)化生產該菌滅活疫苗及防控魚類嗜水氣單胞菌病提供基礎資料。
1材料與方法
1.1材料
嗜水氣單胞菌GZ1株由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室保存。
胰蛋白胨、酵母粉與瓊脂糖均購自上海博微生物科技有限公司；NaCl購自重慶川江化學試劑公司；HCl（分析純度38%）和NaOH（分析純度32%），均購自杭州聯(lián)科生物有限公司；可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、硫酸鎂等均購自上成都市科龍化工試劑廠。
1.2方法
1.2.1菌種培養(yǎng)方法
將菌株劃線接種在以胰蛋白胨為氮源、酵母粉為碳源的LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24h，挑取單個菌落，接種LB液體培養(yǎng)基，30℃搖床振蕩培養(yǎng)24h，8000r/min，離心5min，取菌體，用無菌PBS洗滌3次，取沉淀，配制成濃度為1×108cfu/mL菌懸液，4℃保藏備用。
1.2.2不同培養(yǎng)條件對嗜水氣單胞菌GZ1株生長狀況的影響
取培養(yǎng)24h菌液，8000r/min離心5min，取菌體，無菌PBS洗滌3次，取菌懸液0.5mL，加PBS至5mL，倍比稀釋，用平板計數法測定菌液細菌含量，以無菌PBS為對照，以菌液細菌含量為Y軸，菌液OD600為X軸，構建回歸方程。
生長曲線的測定：將上述菌液接種于LB液體培養(yǎng)基，30℃搖床振蕩（180r/min）培養(yǎng)，用分光光度計測定培養(yǎng)第2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、12℃、14℃、18℃、24℃、36℃、48h菌液OD600，用回歸方程公式計算細菌濃度，以培養(yǎng)時間為橫坐標，細菌濃度為縱坐標，繪制嗜水氣單胞菌生長曲線。
溫度：培養(yǎng)溫度分別設為4℃、25℃、28℃、30℃和37℃，方法同1.2.2，24h時以無菌LB液體培養(yǎng)基為對照，每個處理設3個重復，比較溫度對GZ1株生長的影響。
pH：用NaOH和HCl調節(jié)培養(yǎng)基pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，每個處理設3個重復，24h時以無菌LB液體培養(yǎng)基為對照，比較pH對GZ1株的影響。
NaCl濃度：分別調制0%、1%、2%、3%、4%和5%NaCl的LB液體培養(yǎng)基，加入1%對數期GZ1株菌液，30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24h，以無菌LB液體培養(yǎng)基為對照，每個處理設3個重復，比較NaCl濃度對GZ1株生長的影響。
Mg2+濃度：添加硫酸鎂，調制Mg2+濃度分別為1mg/L、2.5mg/L、5mg/L和10 mg/L的LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h時以無菌LB液體培養(yǎng)基為對照，每個處理設3個重復，比較Mg2+濃度對GZ1株生長的影響。
碳源：用可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸、碳酸鈉配制成碳濃度為0.42 g/L的不同碳源培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h時以無菌LB液體培養(yǎng)基為對照，每個處理設3個重復，比較碳源對GZ1株生長的影響。
氮源：用氯化銨、硫酸銨、尿素、蛋白胨、酵母粉配制成氮濃度為0.71g/L的不同氮源培養(yǎng)基，加入1%對數期GZ1株菌液30℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24h，無菌LB液體培養(yǎng)基為對照，每個處理設3個重復，比較氮源對GZ1株生長的影響。
1.2.3正交試驗設計
在單因素對嗜水氣單胞菌GZ1株生長影響的基礎上，取溫度、pH、NaCl濃度、Mg2+濃度4個因素作為考察因素，每個因素設3個水平，以細菌濃度為指標，設計正交試驗表1。
表1正交試驗設計表
1.2.4數據處理
結果以平均數和標準偏差表示（x±s），用excel、SPSS19.0軟件進行分析。
2結果與分析
2.1嗜水氣單胞菌GZ1株的濃度與OD600的線性方程與生長曲線
細菌含量與OD600成線性關系（圖1），其回歸方程為：Y=17.65X+0.43，Y為細菌含量（×108cfu·mL-1），X為OD600。
圖1嗜水氣單胞菌GZ1株的濃度與OD600的線性方程
由圖2可知，在30℃時，前12h為該菌生長延遲期，12～24h為生長對數期，24～36h為生長穩(wěn)定期，36 h后進入衰亡期。
圖2嗜水氣單胞菌GZ1株生長曲線
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