摘要
目的
探究甘膽口服液(Gan Dan oral liquid,GD)對副溶血弧菌的體外抑菌活性，并從轉(zhuǎn)錄組水平解析GD抗副溶血弧菌的分子機制。
方法
基于最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)、最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)和抑菌動態(tài)生長曲線，評價GD對副溶血弧菌的體外抑菌活性；通過掃描電鏡(scanning electron microscopy,SEM)和透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)分析GD處理對副溶血弧菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響；利用轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)技術(shù)分析1/4MIC濃度的GD處理對副溶血弧菌轉(zhuǎn)錄組的影響，并采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)進行驗證。
結(jié)果
GD對副溶血弧菌具有較好體外抑菌活性，其MIC和MBC值分別為7.6 mg/mL和15.2 mg/mL。1/4MIC濃度的GD處理破壞了副溶血弧菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性，影響了細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致胞內(nèi)大分子物質(zhì)外漏。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，GD處理顯著改變了副溶血弧菌的轉(zhuǎn)錄組，造成1 074個基因顯著上調(diào)，以及1 179個基因顯著下調(diào)。其中，下調(diào)基因主要富集在肌苷酸、核糖核苷合成代謝以及檸檬酸循環(huán)等通路，上調(diào)基因主要涉及轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞壁合成代謝等通路。
結(jié)論
GD可能通過破壞菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，抑制細(xì)菌的能量代謝和生物合成等功能，進而對副溶血弧菌產(chǎn)生抑菌作用。
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種嗜鹽性革蘭氏陰性菌，廣泛分布于海洋、河口，也常見于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中。該菌具有條件性致病的特性，在環(huán)境惡化、宿主機體免疫下降時可入侵水生動物，導(dǎo)致病害暴發(fā)。據(jù)報道，副溶血弧菌可感染魚、蝦、蟹、貝等數(shù)十種海水、淡水養(yǎng)殖動物，每年給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟損失。副溶血弧菌也是一種食源性致病菌，人類誤食該菌感染的水產(chǎn)品，可能出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、腹痛等急性腸胃炎癥狀，嚴(yán)重時引發(fā)敗血癥，導(dǎo)致多器官衰竭甚至死亡。目前，抗生素仍是治療水產(chǎn)動物副溶血弧菌感染的主要藥物，但長期使用抗生素導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性，并在水產(chǎn)品中留下藥物殘留等諸多問題。2019年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等10部委聯(lián)合發(fā)布了《關(guān)于加快推進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的若干意見》，其中明確指出要開展水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥減量行動，開發(fā)綠色安全的抗生素替代產(chǎn)品。
中草藥是中華民族的瑰寶，具有低毒副、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，已被用作抗生素的重要替代品，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物弧菌病的防治中。據(jù)報道，在飼料中添加500 mg/kg三黃散或0.6%青蒿素，可增強凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的免疫和抗氧化能力，并降低其在副溶血弧菌侵染后的死亡率。五倍子也被報道能抑制副溶血弧菌生長，其水提取物的體外最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)低于0.2 mg/mL，而且用20 mg/L的五倍子水提取物對副溶血弧菌感染的泥蟹(Scylla paramosain)進行藥浴治療，可有效降低泥蟹的死亡率。中藥復(fù)方在病原菌方面往往優(yōu)于單味中藥的效果，在體外試驗中，烏梅與石榴皮聯(lián)用配伍對副溶血弧菌的MIC值為7.81 mg/mL，而烏梅、石榴皮單味藥物的MIC值均為31.25 mg/mL；240 mg/mL的黃連、板藍根、黃柏中藥復(fù)方對河流弧菌(V.fluvialis)的抑菌作用強大，其效果優(yōu)于單味中藥的抑菌效果。目前，關(guān)于中草藥抗副溶血弧菌的作用機制已進行一些探索。據(jù)報道，檸檬草精油、原茶兒酸、黃芩醇提物可能通過破壞副溶血弧菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、干擾細(xì)胞能量代謝、抑制生物被膜形成等途徑發(fā)揮抑菌作用。然而，現(xiàn)有研究僅從宏觀角度初步分析了這些中藥的抗菌機制，對于中草藥抗弧菌的分子機制仍不清楚。
近年來，隨著基因組學(xué)的飛速發(fā)展，高通量測序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于功能基因的挖掘、分子標(biāo)記的篩選等研究。通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，能夠全面研究藥物干預(yù)后菌體細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄基因的表達變化，從而系統(tǒng)解析藥物的作用機制。甘膽口服液(Gan Dan oral liquid,GD)是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)的國家三類新獸藥(獸用)，其主要成分包括甘草、板藍根、人工牛黃、冰片等。程安達等研究發(fā)現(xiàn)，甘膽口服液對副溶血弧菌引起的對蝦肝胰腺損傷有良好的修復(fù)作用，但GD對副溶血弧菌的作用機制尚不清楚。本研究通過抑菌活性、電鏡觀察等指標(biāo)，明確GD對副溶血弧菌的抑菌作用，并利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-Seq)分析GD對副溶血弧菌轉(zhuǎn)錄組的影響，解析其中關(guān)鍵的差異表達基因和通路，以期為副溶血弧菌防治提供理論基礎(chǔ)。
相關(guān)新聞推薦
1、不同培養(yǎng)溫度下大腸桿菌的生長曲線測量數(shù)據(jù)
3、闡明膿毒癥中腸道微生物群和代謝物的組成及其與疾病進展的關(guān)系（二）