3．vgrG基因缺失后細菌的菌體黏度測定：
高毒力Kpn通常具有較厚的莢膜，較高的細菌黏度，中低速離心后高黏度的菌體不會完全沉淀在離心管底部，因此可以通過此方法定性判斷菌株毒力。將WT株、ΔvgrG株和CΔvgrG株培養(yǎng)至A 600值約為2.0，離心后測定上清液A 600值即上清液中菌體含量。WT株上清液A 600值顯著高于缺失株ΔvgrG[(0.96±0.04)vs(0.38±0.05)，t＝9.72，P<0.05]，表明細菌缺失vgrG后黏度下降；CΔvgrG株離心后上清液吸光度值雖然略低于WT株，但是仍然顯著高于ΔvgrG株(P<0.05)，該結果也間接表明CΔvgrG株中vgrG可以表達，毒力基本得到恢復。黏度通常與Kpn毒力呈正相關，提示該基因可能參與毒力調節(jié)(圖3B)。
4．vgrG基因缺失后細菌對上皮細胞的黏附變化：
選擇人肺上皮細胞A549建立細菌黏附模型。WT株對A549細胞的黏附數(shù)量顯著高于ΔvgrG株[(5 367.00±318.00)CFU vs(4 067.00±88.19)CFU，t＝3.94，P<0.05]，CΔvgrG株對細胞的黏附菌量也顯著高于ΔvgrG株(P<0.05)。以上結果表明vgrG參與了Kpn對上皮細胞的黏附過程(圖4A)。
細菌對細胞的黏附與巨噬細胞胞內存活能力
注：A：細菌對A549細胞的黏附數(shù)量；B：細菌在Raw264.7細胞中不同時間點的存活率
5．vgrG基因缺失后細菌抵抗巨噬細胞殺傷變化：
細菌感染6 h后，WT株和ΔvgrG株在巨噬細胞中的存活率沒有顯著差異[(33.50±1.50)%vs(22.50±1.50)%，t＝3.77，P>0.05]；ΔvgrG株和CΔvgrG株之間存活率也無顯著差異(P>0.05)。細菌感染12 h后，WT株在巨噬細胞中的存活率顯著高于ΔvgrG株[(69.00±1.00)%vs(47.50±2.50)%，t＝7.99，P<0.05]；ΔvgrG株的存活率也顯著低于CΔvgrG株(P<0.05)。Kpn不是專職的胞內寄生菌，進入巨噬細胞后僅可以短暫存活，隨著巨噬細胞殺傷作用的逐漸激活，ΔvgrG株的存活率與WT株和CΔvgrG株相差越來越大，提示vgrG參與了Kpn在巨噬細胞中的生存(圖4B)。
6．vgrG基因缺失后細菌對小鼠的毒力變化：
以致死劑量Kpn感染小鼠觀察10 d內存活率，WT株組小鼠存活率顯著低于ΔvgrG株組[(16.67±8.82)%vs(53.33±6.67)%，t＝3.32，P<0.05]；以半致死劑量Kpn感染小鼠，WT株組小鼠肺臟細菌數(shù)顯著多于ΔvgrG株組[(4.97±0.06)lg CFU/g vs(4.05±0.04)lg CFU/g，t＝12.27，P<0.01]，CΔvgrG株組小鼠肺臟細菌數(shù)也顯著多于ΔvgrG株組(P<0.01)，以上結果提示vgrG參與了Kpn對小鼠的致病性(圖5)。
細菌對小鼠的致病性評價
注：A：細菌感染小鼠后10 d內生存率；B：不同細菌感染小鼠后在肺臟的定殖數(shù)量
討論
T6SS廣泛存在于致病性革蘭陰性菌中，可以不經(jīng)過細胞表面受體，通過與真核或原核細胞直接接觸來快速轉運效應蛋白，在細菌的識別異己和致病性方面具有重要作用，這大大提高了菌體的生存競爭能力。
T6SS普遍被認為是一種毒力因子，它可以將酶、毒素或其他蛋白質注入競爭細菌或宿主細胞。文獻顯示，T6SS編碼在包含至少13個保守核心基因(tssA~tssM)的基因簇內，這些基因編碼的蛋白質構成了分泌裝置的基本組成部分。部分Kpn中也檢測到了這13個典型T6SS的保守基因。這些基因編碼的蛋白質構成了T6SS的3個基礎結構，包括噬菌體樣注射裝置、膜復合物和分子伴侶。T6SS最顯著的特征是其噬菌體注射裝置狀結構，由針狀結構、鞘復合體和底板組成，其中針狀結構又包括Hcp和VgrG，它們是可以分泌到細胞外環(huán)境中的轉運蛋白。
VgrG作為T6SS的重要核心蛋白，形成細胞穿刺尖端，Hcp則形成運輸效應蛋白的尾管結構。VgrG不僅是T6SS的直接相互作用裝置，也是T6SS的分泌蛋白，具有強毒力感染作用，當VgrG從Hcp管中分離出來時，T6SS的分泌蛋白也會通過Hcp管釋放到宿主細胞中。穿刺尖端復合物通常由VgrG三聚體和錐形的脯氨酸-丙氨酸-丙氨酸-精氨酸(prolinealanine-alanine-arginine，PAAR)結構域蛋白組成。針狀結構(Hcp-VgrG-PAAR結構)被確定為T6SS中唯一進入靶細胞的部分，因此，T6SS效應子與針狀結構緊密相關。錐形PAAR被認為可以增強T6SS"矛"的鋒利度，從而實現(xiàn)有效穿透。
有報道腸道病原體會利用T6SS來拮抗共生的腸道大腸埃希菌，從而促進定殖和疾病發(fā)展?？漳c彎曲菌中的T6SS已被證明對體外宿主細胞的黏附和侵襲十分重要；Kpn T6SS有助于細菌競爭、細胞侵襲、Ⅰ型菌毛表達和體內定殖；鮑曼不動桿菌敲除vgrG基因后對氯霉素的耐藥性降低，對真核細胞黏附性和對小鼠致死性下降，但與生物膜形成無關；腸道外致病性大腸埃希菌VgrG1蛋白參與抗菌能力和與細胞的相互作用以及在宿主體內繁殖。本研究發(fā)現(xiàn)Kpn缺失vgrG后細菌體外生長能力不受影響，但是黏度下降，且對A549細胞的黏附與巨噬細胞胞內存活能力降低，對小鼠的致病性亦降低，表明vgrG對Kpn的致病性具有重要影響。
本研究構建了Kpn vgrG基因缺失株與回補株，并發(fā)現(xiàn)缺失該基因后細菌的致病力顯著降低，表明vgrG有潛力成為防治Kpn的新靶點，但vgrG參與細菌致病力的機制需要進一步探究。
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