摘要
目的
分析胸膜肺炎放線桿菌（APP）臨床分離株的優(yōu)勢血清型，獲得疫苗候選菌株。
方法
從國內(nèi)疑似分離株中鑒定獲得53株APP菌株，鑒定各菌株血清型及評價其生物學特性后，利用大蠟螟和小鼠模型篩選評估有價值的疫苗候選菌株。
結(jié)果
53株APP中血清型占比由高到低依次為1、7、15、5型，各菌株在體外生長存活能力強，具有不同程度的溶血活性。MIC結(jié)果顯示，分離菌株對氟苯尼考敏感度較低，而對頭孢類藥物高度敏感。用大蠟螟和小鼠模型從每個血清型菌株中各篩選到一株高毒力候選菌株。其中，1型菌株制備的滅活疫苗能夠以小于商品化疫苗中1型菌株1/5的劑量，保護100%同血清型攻毒小鼠存活。同時，商品化疫苗中缺乏的15型菌株制備的滅活疫苗對同血清型攻毒小鼠保護率為66.7%，高于商品化疫苗的保護率。
結(jié)論
本研究篩選獲得高毒力的優(yōu)勢血清型1、5、7、15型菌株各一株，根據(jù)免疫劑量和免疫保護率分析，其中的1型菌株和15型菌株有開發(fā)為新疫苗候選菌株的潛力。
胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是豬的重要呼吸系統(tǒng)病原菌，能引起豬傳染性胸膜肺炎，該病具有傳染性強、致死率高的特點，急性病例以纖維性、出血性胸膜肺炎為特征，在世界范圍內(nèi)對養(yǎng)豬業(yè)造成廣泛危害。抗生素是防治APP的有效手段，隨著我國減抗、限抗政策的推進，APP耐藥性問題也日益受到關注，為了減少抗生素的使用量，控制細菌耐藥性的發(fā)生率，疫苗的使用顯得更加重要。
根據(jù)細菌脂多糖與莢膜多糖等抗原不同，可將APP分為19個血清型。不同國家和地區(qū)的APP流行學血清型各不完全相同。在歐洲，血清型2、3、6、9較為流行，而墨西哥則以血清型1、3、5b、7流行最廣泛，澳大利亞和韓國流行的優(yōu)勢血清型有1型和5型。2001年，逯忠新等經(jīng)過流行病學調(diào)查7個不同省份流行血清型主要有1、3和7型；馬爽等從23個省份1990—2014年的病料中分離鑒定到62株APP，其中2、5、7型菌株數(shù)量占總數(shù)的77.5%，但根據(jù)毒力強弱結(jié)果的分析，引起危害較大的主要為1、5、7型。隨著時間變化，近幾年國內(nèi)5型、8型及15型等血清型也表現(xiàn)出流行趨勢，而3型菌株檢出率有所降低，盧碧凱等對臨床分離株鑒定發(fā)現(xiàn)8型為近幾年浙江地區(qū)優(yōu)勢血清型，其次為5、7、15型。滅活疫苗具有安全穩(wěn)定、無返毒風險、易生產(chǎn)和運輸?shù)葍?yōu)點，不同國家和地區(qū)需要根據(jù)本地流行血清型研制相應的多價滅活疫苗。目前國內(nèi)使用的商品化滅活疫苗抗原主要是血清型1、2、7型菌株，近幾年也有研究者在山東地區(qū)分離到APP血清1、5、7型，以此制備三價滅活疫苗并評價其在豬身上的免疫保護效果。由于APP不同血清型之間交叉保護能力低，而血清流行情況又不斷發(fā)生變化，已有的商品化疫苗可能對新流行的血清型菌株保護效果有限。因此，有必要在了解國內(nèi)APP最新流行的優(yōu)勢血清型的基礎上篩選新的疫苗候選菌株。
本研究擬對國內(nèi)2021—2022年的APP臨床分離菌株進行血清型分型鑒定，檢測其生物學特性，并對其耐藥性進行分析；同時篩選體外生長狀況良好、毒力強的菌株作為疫苗候選菌株，在小鼠體內(nèi)評價其免疫保護力，以期為傳統(tǒng)疫苗的更新提供候選毒株。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株及實驗動物
試驗所用的APP臨床菌株為2021—2022年疑似患有豬傳染性胸膜肺炎的發(fā)病豬的病料中獲得，由武漢科前生物股份有限公司診斷實驗室分離并保存，臨床分離菌株來源于廣東、甘肅、四川等10個省份，其中，26株來自江西；7株來自云南；6株來自甘肅；4株來自陜西；3株來自海南；2株來自四川；2株來自福建；山西、廣東、江蘇各分離到1株。大蠟螟幼蟲購自武漢維物起源生物科技有限公司；6周齡Balb/c雌鼠和4周齡KM雌鼠購自華中農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心。
1.1.2主要試劑
胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白酶大豆肉湯（TSB）購自美國BD公司；水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（MH）購自OXOID北京拜爾迪生物技術有限公司；2×Taq Mixture及BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自康為世紀生物科技有限公司；DNA Marker購自Takara公司；羊抗鼠HRP酶標二抗購自武漢三鷹技術有限公司；QIAGEN Multiplex PCR Kit購自德國QIAGEN公司；所有抗生素均購自biosharp蘭杰柯公司；豬傳染性胸膜肺炎三價滅活疫苗購自武漢科前生物股份有限公司。
1.2方法
1.2.1臨床菌株的鑒定及血清型分型
使用APP特異性基因apxIV片段引物進行鑒定，大小為422 bp，陽性對照為實驗室保存的血清1型菌株4 074。進一步采用針對APP 1-15血清型特異性基因的引物進行擴增鑒定各菌株血清（表1）。PCR的反應體系為：模板1μL，2×Multiplex PCR Master Mix 10μL，上游引物各1μL，下游引物各1μL，ddH2O補齊至20μL。PCR反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性15 s；60℃退火90 s；72℃延伸150 s；30個循環(huán)后；68℃再延伸10 min，PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳。其中APP血清型1型、5型、7型和15型特異性基因分別為cps1B（959 bp）、cps5B（825 bp）、cps7E（601 bp）、cpscps15B和cps15C（1 595 bp）。
表1試驗所用引物
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