小檗堿（berberine，C20H19NO5，Mw 336.37）是一種具有廣泛藥理作用的異喹啉類生物堿，在體內(nèi)可以發(fā)揮降糖、降脂、抗氧化、抗感染等多種功能。其中，小檗堿對腸道細(xì)菌感染的治療作用是最早被人們認(rèn)識并運用到臨床當(dāng)中的。而小檗堿治療腸道細(xì)菌感染的基礎(chǔ)是其容易集留在腸道中，并且有利于改善腸道菌的菌群失衡。
腸道菌群是一個復(fù)雜的由多種細(xì)菌共同組成的菌群系統(tǒng)，參與機(jī)體的多種生理過程。早期研究中，腸道菌群更多的被認(rèn)為是和消化、營養(yǎng)吸收密切相關(guān)。隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)腸道菌群還和人體的健康密切相關(guān)，比如能通過自身屏障影響機(jī)體免疫，菌群失調(diào)與糖尿病、心血管疾病、肥胖等代謝性疾病有重要關(guān)系等。腸道菌群更像是一個隱形的“器官”，影響著人類的健康。腸道菌群種類繁多，包括腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、芽孢桿菌等。在這些腸道菌中，大部分都屬于專性厭氧菌，也是共生菌。還有少數(shù)一些細(xì)菌屬于致病菌，比如導(dǎo)致腹瀉的痢疾志賀菌、弗氏志賀菌，引起食物中毒的沙門菌等。
本文通過測定小檗堿對多種腸道微生物的體外抑制作用，以及小檗堿對代表性腸道菌群生長曲線的影響，為小檗堿與腸道菌的相互作用研究提供參考。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1主要試劑鹽酸小檗堿購于中國藥品生物制品檢定研究院；左氧氟沙星（Levo）購于美國Sigma公司；LB、NB、MRS、TSA、RCM微生物培養(yǎng)基均購于美國BD公司。
1.1.2菌株沙門菌、弗氏志賀菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳酸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難梭菌、丁酸梭菌均購買于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）；痢疾志賀菌、致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、阿氏腸桿菌、陰溝腸桿菌、阪崎腸桿菌、單增李斯特菌購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。
1.1.3儀器Orion Model 828型電子pH計為德國Sartorius公司產(chǎn)品；MCV-B161Sb超凈工作臺為日本Sanyo公司產(chǎn)品；NBS Innova 4落地式變溫?fù)u床購于德國Eppendorf公司；Spectrostar分光光度計為德國BMG Labtech公司產(chǎn)品；AW 200SG型厭氧培養(yǎng)箱購于英國Electrotek公司。
1.2方法
1.2.1菌種活化取冷凍干燥的待測菌株，在超凈工作臺中接入無菌的相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床180 r/min過夜培養(yǎng)（需氧細(xì)菌在普通變溫?fù)u床中培養(yǎng)，厭氧細(xì)菌在厭氧箱搖床中培養(yǎng)）。
1.2.2藥物溶液配置將鹽酸小檗堿用DMSO溶解，在超凈工作臺中以0.22μm微孔濾膜濾過，配置成5 mg/ml的藥物儲存液。之后再用相應(yīng)的培養(yǎng)基倍比稀釋成2.048、1.024、0.512、0.256、0.128、0.064、0.032、0.016 mg/ml藥物使用液。左氧氟沙星也以相同的方法配置成0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 mg/ml藥物使用液。同時設(shè)立不加小檗堿的相同濃度的DMSO溶液（也以相應(yīng)的培養(yǎng)基稀釋）作為空白對照。
1.2.3小檗堿對不同腸道菌群最小抑菌濃度（MIC）的測定使用試管倍比稀釋法進(jìn)行測定。取無菌試管9支，每支加入1 ml待測細(xì)菌培養(yǎng)液（106CFU/ml），第1支至第8支分別加入倍比稀釋的鹽酸小檗堿使用液1 ml，至終濃度分別為1.024、0.512、0.256、0.128、0.064、0.032、0.016、0.008 mg/ml，第9支加入不加藥的培養(yǎng)基作為空白對照。左氧氟沙星也以同樣的方法稀釋至藥物終濃度為0.016、0.008、0.004、0.002、0.001、0.0005 mg/ml。將各個試管分別置于37℃搖床中振蕩過夜培養(yǎng)。12 h后觀察細(xì)菌生長情況。與空白對照相比，液體清澈為有抑菌活性，混濁為有細(xì)菌生長。無細(xì)菌生長的最小藥物濃度即為MIC值。
1.2.4小檗堿對細(xì)菌生長曲線的影響選取有代表意義的4株菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923、痢疾志賀菌CICC10983、弗氏志賀菌ATCC12022、沙門菌ATCC13076。將待測菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋至106CFU/ml。以鹽酸小檗堿1/8、1/4、1/2倍MIC作為加藥濃度，同時設(shè)立不加藥的空白對照。放入37℃搖床中振蕩培養(yǎng)，在0～12 h每隔1小時取樣0.5 ml。用分光光度計測量OD600值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制不同加藥濃度下細(xì)菌的生長曲線。
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