2.3噬菌體A149的一步生長曲線
噬菌體A149的一步生長曲線測定結(jié)果如圖2所示，噬菌體A149的潛伏期≤5 min，裂解期為5?30 min，裂解量約為912 PFU/cell，一個裂解周期約為30 min。
圖2噬菌體A149的一步生長曲線
2.4噬菌體A149的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性
在不同溫度下測定噬菌體A149的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3A所示，噬菌體A149在較寬的溫度范圍(20?50℃)穩(wěn)定存活，60℃時滴度略有下降，70℃及以上完全失活；對噬菌體A149在不同pH下的穩(wěn)定性進行測定，結(jié)果如圖3B所示，噬菌體A149在pH 4.0?10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定存活，在pH 11.0時滴度略微下降，pH值低于3.0或高于12.0時完全失活。
圖3噬菌體A149的溫度穩(wěn)定性(A)和pH穩(wěn)定性(B)
小結(jié)
噬菌體A149的最佳感染復數(shù)為0.001，具有短尾噬菌體科(Podoviridae)的典型形態(tài)特征。噬菌體A149潛伏期短(≤5 min)，暴發(fā)量高(約912 PFU/cell)。噬菌體A149在較寬的溫度范圍(20?50℃)穩(wěn)定存活，60℃滴度略有下降，70℃及以上完全失活；在pH 4.0?10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定存活，在pH 11.0時滴度略有下降，pH低于3.0或高于12.0時完全失活。
2.5噬菌體的全基因組分析
噬菌體A149的全基因組測序結(jié)果顯示(圖4)，全基因組長度為18 561 bp，基因組為環(huán)狀雙鏈，G+C含量為33.13%。通過分析全基因組的注釋，表明噬菌體A149含有26個推定的開放閱讀框(open reading frame,ORF)，而已知功能的ORF有13個，注釋率約為50%(13/26)，其余的ORF均被注釋為假定蛋白(hypothetical protein)。該噬菌體的編碼序列(coding sequence,CDS)核酸序列長度區(qū)間為138?2 349 bp，所有ORF總長為17 778 bp，基因組中基因密度約達到95.78%。
全基因組Blastn分析顯示，噬菌體A149在分類上屬于病毒界(Viruses)香港病毒界(Heunggongvirae)雙鏈DNA病毒門(Duplodnaviria)有尾噬菌體亞門(Uroviricota)有尾噬菌體綱(Caudoviricetes)朗特里噬菌體科(Rountreeviridae)薩爾斯噬菌體亞科(Sarlesvirinae)哥白尼病毒屬(Copernicusvirus)。通過分析噬菌體A149與其他3種腸球菌噬菌體的比較基因圈圖(圖4)，發(fā)現(xiàn)噬菌體A149的全基因組序列與腸球菌噬菌體AE4-17(91.01%)、Ef7.3(95.94%)和Efmus4(92.34%)具有較高的遺傳相似性，尤其是噬菌體A149的基因序列與腸球菌噬菌體Ef7.3的基因序列差異在5%以內(nèi)，即兩者屬于同一種的腸球菌噬菌體。
根據(jù)噬菌體A149蛋白的功能預測結(jié)果，表明噬菌體A149基因組中包含噬菌體結(jié)構(gòu)、基因復制調(diào)控及裂解相關(guān)的基因，而在全基因序列中未發(fā)現(xiàn)毒力或者抗生素耐藥相關(guān)的基因，所以噬菌體A149不會成為跨物種基因轉(zhuǎn)移的載體，可用于噬菌體療法。
圖4噬菌體A149全基因組測序分析從內(nèi)到外分別是：最里面的黑圈代表基因組的大小，帶有波峰的黑圈代表(G+C)mol%，向外(內(nèi))表示含量大(小)于全基因組平均(G+C)mol%；含有紫綠色波峰的黑色圓圈表示G+C偏嗜性G–C/G+C，向外(內(nèi))代表大(小)于0。紅色、淺藍色、綠色、黃色的4個圓圈代表A149、AE4-17、Ef7.3和Efmus4的基因組序列，顏色深淺代表了相似性程度；最外側(cè)圈層為開放閱讀框，紅色表示已注釋的蛋白，綠色為假定蛋白。
2.6噬菌體A149的系統(tǒng)發(fā)育樹分析
基于噬菌體末端酶大亞基構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖5)，噬菌體A149與AE4-17、Ef7.3和Efmus4等噬菌體的親緣關(guān)系最近，均屬于短尾噬菌體科(Podoviridae)。
圖5基于噬菌體末端酶大亞基氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹括號中的序號為噬菌體基因組的序列號；分支上的數(shù)字表示可信度，數(shù)值越接近100，可信度越高；標尺代表遺傳距離。
2.7噬菌體A149的裂解譜測定
測定噬菌體A149針對多種細菌的裂解譜，結(jié)果如表2所示。噬菌體A149對糞腸球菌具有廣譜的裂解活性，對所測試的糞腸球菌有86.4%的覆蓋率(51/59)；對所測試的屎腸球菌(0/5)、金黃色葡萄球菌(0/2)、單核增生李斯特氏菌(0/2)和大腸桿菌(0/2)均無裂解活性。該結(jié)果表明噬菌體A149具有對糞腸球菌種內(nèi)特異的廣譜裂解效果。
表2噬菌體A149的裂解譜測定
++：透亮空斑；+：模糊空斑：?：無空斑。
2.8噬菌體A149的體外抑菌曲線測定結(jié)果
測定噬菌體A149對耐萬古霉素糞腸球菌V583的體外抑菌曲線，結(jié)果如圖6所示，在不添加噬菌體的條件下，V583在8 h左右到達穩(wěn)定期；而在添加噬菌體149的條件下，V583的生長被顯著抑制，直到11 h后才開始生長，且不同MOI的噬菌體添加量對V583的抑制時間無顯著性差異。添加噬菌體11 h后細菌開始生長是由于噬菌體抗性菌株的產(chǎn)生和生長。該結(jié)果表明噬菌體A149對V583的生長具有較強的體外抑制能力。
圖6不同感染復數(shù)下噬菌體A149的體外抑菌曲線
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