1材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗(yàn)用菌株和噬菌體來(lái)源
本實(shí)驗(yàn)所涉及的12株沙門(mén)菌(包括4株腸炎沙門(mén)菌、4株雞白痢沙門(mén)菌及4株鼠傷寒沙門(mén)菌)和52株大腸桿菌信息詳見(jiàn)表1。分離噬菌體的污水樣品采集于揚(yáng)州市邗江區(qū)文昌中路附近的二道河水系。
表1宿主譜測(cè)定涉及細(xì)菌信息
菌株編號(hào)細(xì)菌16S鑒定細(xì)菌來(lái)源
C79-13雞白痢沙門(mén)菌中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
CVCC535雞白痢沙門(mén)菌中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽科學(xué)研究所
CVCC540雞白痢沙門(mén)菌中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心
CVCC534雞白痢沙門(mén)菌中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心
CMCC50336腸炎沙門(mén)菌中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
C50041腸炎沙門(mén)菌中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
ATCC13076腸炎沙門(mén)菌中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽科學(xué)研究所
CVCC3377腸炎沙門(mén)菌中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心
CVCC542鼠傷寒沙門(mén)菌中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心
W32鼠傷寒沙門(mén)菌中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
J002鼠傷寒沙門(mén)菌中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
S002鼠傷寒沙門(mén)菌中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
BL21(DE3)大腸桿菌賽默飛世爾公司
XL1-Blue大腸桿菌上海維地生物技術(shù)有限公司
CVCC1553大腸桿菌中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心
S14大腸桿菌北京全式金有限公司
DH5α大腸桿菌賽默飛世爾公司
ER2738大腸桿菌北京天恩澤基因科技有限公司
T144大腸桿菌廣州碧云天生物有限公司
TG1大腸桿菌廣州碧云天生物有限公司
BLT 5403大腸桿菌北京天恩澤基因科技有限公司
ATCC25922大腸桿菌中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心
AD5大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
AE1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
AE4大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
AG4大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
Y AD2大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
Y AE1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
Y AE2大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
Y AE4大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
Y AF4大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
Y AG3大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
X5大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YX1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YX2大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YX5大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YX6大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
W5大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
W6大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YW1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YW2大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YW4大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
Y6大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
AA2大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YY1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YZ4大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YZ6大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YAA5大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YAA6大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
V1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
W1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
M1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
M2大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YM4大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
P2大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YL1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YL3大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YO1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YP3大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
YS2大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
1--1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
Y3-2大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
Y108-1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
Y193-1大腸桿菌實(shí)驗(yàn)室保藏
1.1.2主要使用試劑及儀器
氯化鈉、胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，0.22μm濾器購(gòu)自浙江塞恩斯科學(xué)儀器有限公司，F(xiàn)ITC(異構(gòu)體Ⅰ)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，蛋白酶K、脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶購(gòu)自翌圣生物科技上海有限公司。透射電鏡(HT7800，日本日立高新技術(shù)公司)和正置熒光顯微鏡(BX53，日本奧林巴斯)皆屬于揚(yáng)州大學(xué)大型設(shè)備共享平臺(tái)。
1.2噬菌體分離與純化
1.2.1噬菌體初篩
將采集的污水樣品經(jīng)紗布過(guò)濾去大顆粒雜質(zhì)后分裝至50 mL離心管中，10 000×g離心10 min后棄去沉淀，取上清液過(guò)0.22μm濾器，此為噬菌體原液，分裝于2 mL離心管內(nèi)存于冰箱4℃?zhèn)溆谩?
1.2.2噬菌體富集
取20μL凍存于-80℃的雞白痢沙門(mén)菌C79-13加入1 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37℃搖床中200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)作為種子液。按1%比例將種子液重新接種到1 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=0.6)時(shí)，加入100μL噬菌體原液繼續(xù)培養(yǎng)3 h后取出，10 000×g離心10 min后收集上清液，經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)入2 mL離心管中保存。
1.2.3噬菌體的分離與純化
取100μL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雞白痢沙門(mén)菌C79-13與100μL少量富集得到的噬菌體液混合，用移液器吹打混勻后全部轉(zhuǎn)移到5 mL LB半固體培養(yǎng)基中混勻，鋪于雙層瓊脂平板的底層膠上，靜置待上層瓊脂液體凝固后，倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)6 h，直至雙層瓊脂平板上出現(xiàn)清晰、透亮、大小均一的噬菌斑。用移液器滅菌槍頭挑取單個(gè)透亮的噬菌斑加入1 mL PBS緩沖液中，并用移液器滅菌槍頭反復(fù)吹打使噬菌斑中噬菌體分散入溶液中，10 000×g離心10 min棄沉淀，取上清液過(guò)0.22μm濾器，取過(guò)濾液體與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宿主菌混合，用雙層瓊脂平板法重復(fù)純化5~6次直至雙層平板上出現(xiàn)的噬菌斑大小一致、透亮程度均一。
1.3噬菌體形態(tài)透射電鏡觀察
用CsCl密度梯度離心法，將濃縮后的噬菌體顆粒滴在銅片上，靜置3 min，用濾紙吸去周?chē)嘤嘁后w，滴加20μL 2%的磷鎢酸(PTA，2%m/V)染色10 min，并在室溫下靜置干燥后，使用透射電鏡觀察噬菌體形態(tài)。
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